Komponent kimiku tat-tubi tal-coil tal-istainless steel 304, L-istruttura tal-ectodomain PACA6 fiha superfamilja kkonservata ta 'proteini assoċjati mal-fużjoni tal-gameti.

Grazzi talli żort Nature.com.Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Sliders li juru tliet artikoli għal kull slide.Uża l-buttuni ta 'wara u li jmiss biex timxi permezz tal-pjastri, jew il-buttuni tal-kontrollur tas-slajds fl-aħħar biex tiċċaqlaq minn kull slide.

SPACA6 hija proteina tal-wiċċ espressa mill-isperma li hija kritika għall-fużjoni tal-gameti waqt ir-riproduzzjoni sesswali tal-mammiferi.Minkejja dan ir-rwol fundamentali, il-funzjoni speċifika ta 'SPACA6 hija mifhuma ħażin.Aħna niċċaraw l-istruttura tal-kristall tad-dominju extraċellulari ta 'SPACA6 b'riżoluzzjoni ta' 2.2 Å, li tiżvela proteina b'żewġ dominji komposta minn mazz ta 'erba' linji u β-sandwiches bħal Ig magħquda minn linkers kważi flessibbli.Din l-istruttura tixbah lil IZUMO1, proteina oħra assoċjata mal-fużjoni tal-gameti, li tagħmel SPACA6 u IZUMO1 membri fundaturi tas-superfamilja ta 'proteini assoċjati mal-fertilizzazzjoni msemmija hawnhekk bħala s-superfamilja IST.Is-superfamilja IST hija strutturalment definita mill-qatta tagħha ta 'erba' helix mibrumin u par ta 'motifi CXXC marbuta mad-disulfide.Tfittxija AlphaFold ibbażata fuq l-istruttura tal-proteome uman identifikat membri ta 'proteini addizzjonali ta' din is-superfamilja;notevolment, ħafna minn dawn il-proteini huma involuti fil-fużjoni tal-gameti.L-istruttura SPACA6 u r-relazzjoni tagħha ma 'membri oħra tas-superfamilja IST jipprovdu r-rabta nieqsa fl-għarfien tagħna tal-fużjoni tal-gameti tal-mammiferi.
Kull ħajja umana tibda b'żewġ gameti aploid separati: l-isperma tal-missier u l-bajda tal-omm.Din l-isperma hija r-rebbieħa ta 'proċess ta' għażla intens li matulu miljuni ta 'ċelluli tal-isperma jgħaddu mill-passaġġ ġenitali femminili, jegħlbu diversi ostakli1 u jgħaddu minn kapaċità, li jsaħħaħ il-motilità tagħhom u l-proċess tal-komponenti tal-wiċċ2,3,4.Anke jekk l-isperma u l-ooċite jsibu lil xulxin, il-proċess għadu ma spiċċax.L-ooċita hija mdawra b'saff ta 'ċelluli cumulus u barriera tal-glikoproteina msejħa zona pellucida, li minnha l-isperma trid tgħaddi biex tidħol fl-ooċita.L-ispermatożoa jużaw taħlita ta 'molekuli ta' adeżjoni mal-wiċċ u enzimi assoċjati mal-membrana u mnixxija biex jegħlbu dawn l-ostakli finali5.Dawn il-molekuli u l-enzimi huma prinċipalment maħżuna fil-membrana ta 'ġewwa u l-matriċi akrosomali u jiġu skoperti meta l-membrana ta' barra ta 'l-isperma tiġi liżata waqt ir-reazzjoni akrosomali6.L-aħħar pass f'dan il-vjaġġ intens huwa l-avveniment tal-fużjoni tal-isperma-bajd, li fih iż-żewġ ċelloli jingħaqdu l-membrani tagħhom biex isiru organiżmu diplojde wieħed7.Għalkemm dan il-proċess huwa innovattiv fir-riproduzzjoni umana, l-interazzjonijiet molekulari meħtieġa huma mifhuma ħażin.
Minbarra l-fertilizzazzjoni tal-gameti, il-kimika tal-fużjoni ta 'żewġ saffi tal-lipidi ġiet studjata b'mod estensiv.B'mod ġenerali, il-fużjoni tal-membrana hija proċess enerġetikament mhux favorevoli li jeħtieġ li katalizzatur tal-proteini jgħaddi minn bidla ta 'konformazzjoni strutturali li ġġib żewġ membrani eqreb lejn xulxin, tkisser il-kontinwità tagħhom u tikkawża fużjoni8,9.Dawn il-katalisti tal-proteini huma magħrufa bħala fusogens u nstabu f'għadd ta 'sistemi ta' fużjoni.Huma meħtieġa għad-dħul virali fiċ-ċelloli ospitanti (eż., gp160 fl-HIV-1, spike fil-koronavirus, hemagglutinin fil-viruses tal-influwenza)10,11,12 plaċenta (syncytin)13,14,15 u fużjonijiet li jiffurmaw il-gameti f'ewkarjoti aktar baxxi ( HAP2/GCS1 fil-pjanti, protisti u artropodi) 16,17,18,19.Il-fusoġeni għall-gameti umani għad iridu jiġu skoperti, għalkemm bosta proteini intwerew li huma kritiċi għat-twaħħil u l-fużjoni tal-gameti.Is-CD9 espress bl-ooċiti, proteina transmembrana meħtieġa għall-fużjoni tal-gameti tal-ġurdien u tal-bniedem, kienet l-ewwel waħda li ġiet skoperta 21,22,23.Għalkemm il-funzjoni preċiża tagħha tibqa 'mhux ċara, rwol fl-adeżjoni, l-istruttura tal-fokus ta' adeżjoni fuq mikrovilli tal-bajd, u/jew il-lokalizzazzjoni korretta tal-proteini tal-wiċċ tal-ooċiti jidher probabbli 24,25,26.Iż-żewġ proteini l-aktar tipiċi li huma kritiċi għall-fużjoni tal-gameti huma l-proteina tal-isperma IZUMO127 u l-proteina tal-oocyte JUNO28, u l-assoċjazzjoni reċiproka tagħhom hija pass importanti fir-rikonoxximent u l-adeżjoni tal-gameti qabel il-fużjoni.Il-ġrieden knockout maskili Izumo1 u l-ġrieden knockout nisa Juno huma kompletament sterili, f'dawn il-mudelli l-isperma tidħol fl-ispazju perivitellin iżda l-gameti ma jingħaqdux.Bl-istess mod, il-konfluwenza tnaqqset meta l-gameti ġew ittrattati b'antikorpi anti-IZUMO1 jew JUNO27,29 f'esperimenti ta' fertilizzazzjoni in vitro tal-bniedem.
Riċentement, ġie skopert grupp ġdid ta 'proteini espressi bl-isperma fenotipikament simili għal IZUMO1 u JUNO20,30,31,32,33,34,35.Proteina 6 assoċjata mal-membrana akrosomali tal-isperma (SPACA6) ġiet identifikata bħala essenzjali għall-fertilizzazzjoni fi studju ta 'mutaġenesi murina fuq skala kbira.L-inserzjoni tat-transġene fil-ġene Spaca6 tipproduċi spermatozoa mhux fużibbli, għalkemm dawn l-ispermatozoa jinfiltraw l-ispazju perivitelin 36 .Studji knockout sussegwenti fil-ġrieden ikkonfermaw li Spaca6 huwa meħtieġ għall-fużjoni tal-gameti 30,32.SPACA6 huwa espress kważi esklussivament fit-testikoli u għandu mudell ta 'lokalizzazzjoni simili għal dak ta' IZUMO1, jiġifieri fl-intima tal-ispermatozoa qabel ir-reazzjoni akrosomali, u mbagħad jemigra lejn ir-reġjun ekwatorjali wara r-reazzjoni akrosomali 30,32.L-omologi ta' Spaca6 jeżistu f'varjetà ta' mammiferi u ewkarjoti oħra 30 u l-importanza tiegħu għall-fużjoni tal-gameti umani ntweriet permezz ta' inibizzjoni tal-fertilizzazzjoni umana in vitro permezz tar-reżistenza għal SPACA6 30 .B'differenza minn IZUMO1 u JUNO, id-dettalji tal-istruttura, l-interazzjonijiet, u l-funzjoni ta 'SPACA6 għadhom mhux ċari.
Biex nifhmu aħjar il-proċess fundamentali sottostanti għall-fużjoni tal-isperma umana u l-bajd, li se jippermettilna ninfurmaw l-iżviluppi futuri fl-ippjanar tal-familja u t-trattament tal-fertilità, għamilna studji strutturali u bijokimiċi SPACA6.L-istruttura tal-kristall tad-dominju extraċellulari ta 'SPACA6 turi mazz ta' erba 'helikali (4HB) u dominju bħal immunoglobulina (Ig-like) konnessi minn reġjuni kważi flessibbli.Kif imbassar fi studji preċedenti, 7,32,37 l-istruttura tad-dominju ta 'SPACA6 hija simili għal dik ta' IZUMO1 uman, u ż-żewġ proteini jaqsmu motif mhux tas-soltu: 4HB b'wiċċ helical trijangolari u par ta 'motifi CXXC marbuta mad-disulfide.Nipproponu li IZUMO1 u SPACA6 issa jiddefinixxu superfamilja akbar, strutturalment relatata ta 'proteini assoċjati mal-fużjoni tal-gameti.Bl-użu ta 'karatteristiċi uniċi għas-superfamilja, wettaqna tfittxija eżawrjenti għall-proteoma uman strutturali AlphaFold, identifikajna membri addizzjonali ta' din is-superfamilja, inklużi diversi membri involuti fil-fużjoni tal-gameti u/jew il-fertilizzazzjoni.Issa jidher li hemm tinja strutturali komuni u superfamilja ta 'proteini assoċjati mal-fużjoni tal-gameti, u l-istruttura tagħna tipprovdi mappa molekulari ta' dan l-aspett importanti tal-mekkaniżmu tal-fużjoni tal-gameti tal-bniedem.
SPACA6 hija proteina transmembrana b'pass wieħed b'glikan wieħed N-linked u sitt bonds disulfide putattivi (Figuri S1a u S2).Aħna esprimew id-dominju extraċellulari ta 'SPACA6 tal-bniedem (residwi 27-246) fiċ-ċelloli Drosophila S2 u purifikat il-proteina bl-użu ta' affinità tan-nikil, skambju ta 'katjoni, u kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs (Fig. S1b).L-ectodomain purifikat PACA6 huwa stabbli ħafna u omoġenju.Analiżi bl-użu ta 'kromatografija ta' esklużjoni tad-daqs flimkien ma 'tixrid ta' dawl poligonali (SEC-MALS) żvelat quċċata waħda b'piż molekulari kkalkulat ta '26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Dan huwa konsistenti mad-daqs tal-ectodomain monomeriku SPACA6, li jindika li l-oligomerizzazzjoni ma seħħitx waqt il-purifikazzjoni.Barra minn hekk, spettroskopija ta 'dikroiżmu ċirkolari (CD) żvelat struttura mħallta α / β b'punt ta' tidwib ta '51.3 °C (Fig. S1d, e).Id-dekonvoluzzjoni tal-ispettri tas-CD żvelat 38.6% elementi α-helical u 15.8% β-stranded (Figura S1d).
L-ectodomain SPACA6 ġie kristallizzat bl-użu ta 'seeding ta' matriċi każwali38 li rriżulta f'sett ta 'dejta b'riżoluzzjoni ta' 2.2 Å (Tabella 1 u Figura S3).Bl-użu ta 'kombinazzjoni ta' sostituzzjoni molekulari bbażata fuq framment u data ta 'fażi SAD b'espożizzjoni tal-bromur għad-determinazzjoni tal-istruttura (Tabella 1 u Figura S4), il-mudell finali raffinat jikkonsisti f'residwi 27-246.Fiż-żmien li l-istruttura ġiet determinata, ma kien hemm l-ebda strutturi sperimentali jew AlphaFold disponibbli.L-ectodomain SPACA6 miżuri 20 Å × 20 Å × 85 Å, jikkonsisti f'seba 'helizes u disa' linji β, u għandu jinja terzjarju tawwali stabbilizzat minn sitt rabtiet disulfide (Fig. 1a, b).Id-densità tal-elettroni dgħajfa fit-tarf tal-katina tal-ġenb Asn243 tindika li dan ir-residwu huwa glycosylation N-linked.L-istruttura tikkonsisti f'żewġ oqsma: mazz ta 'erba' helix N-terminal (4HB) u dominju simili għal Ig C-terminal b'reġjun taċ-ċappetta intermedju bejniethom (Fig. 1c).
a Struttura tad-dominju extraċellulari ta 'SPACA6.Dijagramma tal-istrixxa tad-dominju extraċellulari ta 'SPACA6, il-kulur tal-katina minn N sa C-terminal minn blu skur għal aħmar skur.Cysteines involuti f'bonds disulfide huma enfasizzati fil-maġenta.b Topoloġija tad-dominju extraċellulari ta 'SPACA6.Uża l-istess skema tal-kulur bħal fil-Figura 1a.c dominju extraċellulari SPANA6.Iċ-ċarts tal-istrixxa tad-dominju 4HB, iċ-ċappetta u l-Ig huma kkuluriti oranġjo, aħdar u blu, rispettivament.Is-saffi mhumiex miġbuda fuq skala.
Id-dominju 4HB ta 'SPACA6 jinkludi erba' helix prinċipali (helix 1-4), li huma rranġati fil-forma ta 'helix helix (Fig. 2a), li jalternaw bejn interazzjonijiet antiparalleli u paralleli (Fig. 2b).Helix addizzjonali żgħira b'dawra waħda (helix 1′) hija mqiegħda perpendikulari mal-qatta, li tifforma trijangolu b'helix 1 u 2. Dan it-trijangolu huwa kemmxejn deformat fl-ippakkjar helical-mdawwar tal-ippakkjar relattivament dens tal-helix 3 u 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminal strip chart.b Dehra ta' fuq ta' mazz ta' erba' helix, kull helix enfasizzat b'blu skur fit-tarf N u aħmar skur fit-tarf Ċ.c Dijagramma ta' rota spirali minn fuq għal isfel għal 4HB, b'kull residwu muri bħala ċirku ttikkettjat b'kodiċi ta' aċidu amminiku b'ittra waħda;l-erba 'aċidi amminiċi biss fil-quċċata tar-rota huma nnumerati.Ir-residwi mhux polari huma kkuluriti isfar, ir-residwi polari mhux iċċarġjati huma kkuluriti fl-aħdar, ir-residwi ċċarġjati b'mod pożittiv huma kkuluriti blu, u r-residwi ċċarġjati b'mod negattiv huma kkuluriti bl-aħmar.d Uċuħ trijangolari tad-dominju 4HB, b'4HBs fl-oranġjo u ċappetti fl-aħdar.Iż-żewġ daħliet juru bonds disulfide f'forma ta 'virga.
4HB huwa kkonċentrat fuq qalba idrofobika ta 'ġewwa komposta prinċipalment minn residwi alifatiċi u aromatiċi (Fig. 2c).Il-qalba fiha rabta disulfide bejn Cys41 u Cys55 li tgħaqqad il-helizes 1 u 2 flimkien fi trijangolu mgħolli ta 'fuq (Fig. 2d).Żewġ rabtiet disulfide addizzjonali ġew iffurmati bejn il-motif CXXC f'Helix 1′ u motif CXXC ieħor misjub fil-ponta tal-β-hairpin fir-reġjun taċ-ċappetta (Fig. 2d).Residwu konservattiv ta 'arginine b'funzjoni mhux magħrufa (Arg37) jinsab ġewwa trijangolu vojt iffurmat minn helices 1′, 1, u 2. Atomi tal-karbonju alifatiċi Cβ, Cγ, u Cδ Arg37 jinteraġixxu mal-qalba idrofobika, u l-gruppi guanidine tiegħu jimxu ċiklikament. bejn il-helizes 1' u 1 permezz ta 'interazzjonijiet bejn is-sinsla Thr32 u l-katina tal-ġenb (Fig. S5a, b).Tyr34 jestendi fil-kavità u jħalli żewġ kavitajiet żgħar li permezz tagħhom Arg37 jista 'jinteraġixxi mas-solvent.
Id-dominji β-sandwich li jixbhu lil Ig huma superfamilja kbira ta' proteini li jaqsmu l-karatteristika komuni ta' żewġ folji β amphipathic multi-stranded jew aktar li jinteraġixxu permezz ta' qalba idrofobika 39. Id-dominju simili għal Ig C-terminal ta' SPACA6 għandu l-istess mudell u jikkonsisti f'żewġ saffi (Fig. S6a).Folja 1 hija folja β ta 'erba' linji (fergħat D, F, H, u I) fejn linji F, H, u I jiffurmaw arranġament anti-parallel, u linji I u D jieħdu interazzjoni parallela.It-Tabella 2 hija folja żgħira ta 'beta bi strands doppji anti-paralleli (fergħat E u G).Ġiet osservata rabta disulfide interna bejn it-tmiem C tal-katina E u ċ-ċentru tal-katina H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Din ir-rabta disulfide hija analoga għar-rabta disulfide fid-dominju β-sandwich ta 'immunoglobulin40,41.
Il-folja β b'erba 'fergħat tidwir tul it-tul kollu tagħha, u tifforma truf asimmetriċi li jvarjaw fil-forma u l-elettrostatika.It-tarf irqaq huwa wiċċ ambjentali idrofobiku ċatt li jispikka meta mqabbel mal-uċuħ irregolari u elettrostatikament diversi li jifdal f'SPACA6 (Fig. S6b, c).A halo ta 'sinsla esposti carbonyl/amino gruppi u ktajjen tal-ġenb polari jdawru l-wiċċ idrofobiku (Fig. S6c).Il-marġni usa huwa kopert minn segment helical b'limitu li jimblokka l-porzjon N-terminal tal-qalba idrofobika u jifforma tliet rabtiet idroġenu mal-grupp polari miftuħ tas-sinsla tal-katina F (Fig. S6d).Il-porzjon C-terminal ta 'dan it-tarf jifforma but kbir b'qalba idrofobika parzjalment esposta.Il-but huwa mdawwar minn ħlasijiet pożittivi minħabba tliet settijiet ta 'residwi ta' arginine doppji (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 u Arg212-Arg214) u histidine ċentrali (His220) (Figura S6e).
Ir-reġjun taċ-ċappetta huwa segment qasir bejn id-dominju helical u d-dominju simili Ig, li jikkonsisti f'saff β bi tliet strandel antiparalleli (fergħat A, B u C), helix żgħira 310, u diversi segmenti helical każwali twal.(Fig. S7).Netwerk ta 'kuntatti kovalenti u elettrostatiċi fir-reġjun taċ-ċappetta jidher li jistabbilizza l-orjentazzjoni bejn 4HB u d-dominju bħal Ig.In-netwerk jista 'jinqasam fi tliet partijiet.L-ewwel parti tinkludi żewġ motifs CXXC (27CXXC30 u 139CXXC142) li jiffurmaw par ta 'bonds disulfide bejn il-β-hairpin fiċ-ċappetta u l-helix 1' f'4HB.It-tieni parti tinkludi interazzjonijiet elettrostatiċi bejn id-dominju bħal Ig u ċ-ċappetta.Glu132 fiċ-ċappetta jifforma pont tal-melħ b'Arg233 fid-dominju bħal Ig u Arg135 fiċ-ċappetta.It-tielet parti tinkludi rabta kovalenti bejn id-dominju bħal Ig u r-reġjun taċ-ċappetta.Żewġ bonds disulfide (Cys124-Cys147 u Cys128-Cys153) jgħaqqdu l-linja taċ-ċappetta ma 'linker li huwa stabbilizzat minn interazzjonijiet elettrostatiċi bejn Gln131 u l-grupp funzjonali tas-sinsla, li jippermetti aċċess għall-ewwel dominju simili Ig.katina.
L-istruttura ta 'l-ectodomain PACA6 u strutturi individwali ta' 4HB u oqsma simili Ig intużaw biex ifittxu rekords strutturalment simili fil-bażijiet tad-dejta tal-proteini 42 .Aħna identifikajna logħbiet b'punteġġi għolja Dali Z, devjazzjonijiet standard żgħar, u punteġġi LALI kbar (l-aħħar huwa n-numru ta 'residwi strutturalment ekwivalenti).Filwaqt li l-ewwel 10 hits mit-tfittxija sħiħa tal-ectodomain (Tabella S1) kellhom punteġġ Z aċċettabbli ta '> 842, tfittxija għal 4HB jew dominju simili għal Ig wera li ħafna minn dawn il-hits kienu jikkorrispondu għal β-sandwiches biss.tinja kullimkien misjuba f'ħafna proteini.It-tliet tfittxijiet kollha f'Dali rritornaw riżultat wieħed biss: IZUMO1.
Ilu ssuġġerit li SPACA6 u IZUMO1 jaqsmu xebh strutturali7,32,37.Għalkemm l-ectodomains ta’ dawn iż-żewġ proteini assoċjati mal-fużjoni tal-gameti jaqsmu biss identità ta’ sekwenza ta’ 21% (Figura S8a), evidenza kumplessa, inkluż mudell ta’ bonds disulfide kkonservat u dominju mbassar C-terminal simili għal Ig fi SPACA6, ippermettiet tentattivi bikrija biex tinbena mudell ta' omoloġija ta' A a ġurdien SPACA6 li juża IZUMO1 bħala mudell37.L-istruttura tagħna tikkonferma dawn il-previżjonijiet u turi l-grad veru ta 'xebh.Fil-fatt, l-istrutturi SPACA6 u IZUMO137,43,44 jaqsmu l-istess arkitettura b'żewġ dominji (Fig. S8b) b'dominji simili 4HB u Ig-like β-sandwich konnessi minn reġjun taċ-ċappetta (Fig. S8c).
IZUMO1 u SPACA6 4HB għandhom differenzi komuni minn qatet spirali konvenzjonali.4HBs tipiċi, bħal dawk misjuba fil-kumplessi tal-proteini SNARE involuti fil-fużjoni endosomal 45,46, għandhom helizes spazjati b'mod uniformi li jżommu kurvatura kostanti madwar assi ċentrali 47. B'kuntrast, id-dominji helical kemm f'IZUMO1 kif ukoll f'SPACA6 kienu mgħawġa, b'kurvatura varjabbli u ippakkjar irregolari (Figura S8d).It-tidwir, probabbilment ikkawżat mit-trijangolu ffurmat mill-helix 1′, 1 u 2, jinżamm f'IZUMO1 u SPACA6 u stabbilizzat bl-istess motif CXXC fuq il-helix 1′.Madankollu, il-bond tad-disulfide addizzjonali misjub f'SPACA6 (Cys41 u Cys55 li jgħaqqdu b'mod kovalenti l-helizes 1 u 2 hawn fuq) joħloq apiċi aktar qawwi fil-quċċata tat-trijangolu, li jagħmel SPACA6 aktar mibrum minn IZUMO1, bi triangoli kavità aktar evidenti.Barra minn hekk, IZUMO1 m'għandux Arg37 osservat fiċ-ċentru ta 'din il-kavità fi SPACA6.B'kuntrast, IZUMO1 għandu qalba idrofobika aktar tipika ta 'residwi alifatiċi u aromatiċi.
IZUMO1 għandu dominju li jixbah lil Ig li jikkonsisti f'folja β doppja u ħames linji43.Il-linja żejda f'IZUMO1 tissostitwixxi l-coil f'SPACA6, li jinteraġixxi mal-linja F biex tillimita r-rabtiet tal-idroġenu tas-sinsla fil-linja.Punt ta 'tqabbil interessanti huwa l-ħlas tal-wiċċ imbassar tad-dominji li jixbħu lill-Ig taż-żewġ proteini.Il-wiċċ IZUMO1 huwa ċċarġjat b'mod aktar negattiv mill-wiċċ SPACA6.Ħlas addizzjonali jinsab ħdejn it-terminal C li jħares lejn il-membrana tal-isperma.F'SPACA6, l-istess reġjuni kienu aktar newtrali jew iċċarġjati b'mod pożittiv (Fig. S8e).Pereżempju, il-wiċċ idrofobiku (truf irqaq) u fosos iċċarġjati b'mod pożittiv (truf usa ') fi SPACA6 huma ċċarġjati b'mod negattiv f'IZUMO1.
Għalkemm ir-relazzjoni u l-elementi ta 'struttura sekondarja bejn IZUMO1 u SPACA6 huma ppreservati tajjeb, l-allinjament strutturali tad-dominji simili Ig wera li ż-żewġ oqsma huma differenti fl-orjentazzjoni ġenerali tagħhom relattiva għal xulxin (Fig. S9).Il-qatta spirali ta 'IZUMO1 hija mgħawġa madwar il-β-sandwich, u toħloq il-forma ta' "boomerang" deskritta qabel f'madwar 50 ° mill-assi ċentrali.B'kuntrast, ir-raġġ helical fl-SPACA6 kien imxaqleb madwar 10 ° fid-direzzjoni opposta.Id-differenzi f'dawn l-orjentazzjonijiet huma probabbli minħabba differenzi fir-reġjun taċ-ċappetta.Fil-livell tas-sekwenza primarja, IZUMO1 u SPACA6 jaqsmu ftit xebh ta' sekwenza fiċ-ċappetta, bl-eċċezzjoni ta' residwi ta' cysteine, glycine, u aspartic acid.Bħala riżultat, il-bonds tal-idroġenu u n-netwerks elettrostatiċi huma kompletament differenti.L-elementi tal-istruttura sekondarja tal-folja β huma kondiviżi minn IZUMO1 u SPACA6, għalkemm il-ktajjen f'IZUMO1 huma ħafna itwal u l-helix 310 (helix 5) hija unika għal SPACA6.Dawn id-differenzi jirriżultaw f'orjentazzjonijiet ta' dominju differenti għal żewġ proteini li kieku kienu simili.
It-tfittxija tagħna fuq is-server Dali wriet li SPACA6 u IZUMO1 huma l-uniċi żewġ strutturi determinati b'mod sperimentali maħżuna fid-database tal-proteini li għandhom din it-tinja partikolari ta '4HB (Tabella S1).Aktar reċentement, DeepMind (Alphabet/Google) żviluppa AlphaFold, sistema bbażata fuq netwerk newrali li tista 'tbassar b'mod preċiż l-istrutturi 3D ta' proteini minn sekwenzi primarji48.Ftit wara li solvejna l-istruttura SPACA6, id-database AlphaFold ġiet rilaxxata, li tipprovdi mudelli ta 'struttura ta' tbassir li jkopru 98.5% tal-proteini kollha fil-proteome uman48,49.Bl-użu tal-istruttura SPACA6 riżolta tagħna bħala mudell ta 'tfittxija, tfittxija ta' omoloġija strutturali għall-mudell fil-proteome uman AlphaFold identifikat kandidati b'xebh strutturali possibbli għal SPACA6 u IZUMO1.Minħabba l-eżattezza inkredibbli ta 'AlphaFold fit-tbassir ta' SPACA6 (Fig. S10a)—speċjalment l-ectodomain ta '1.1 Å rms meta mqabbel mal-istruttura solvuta tagħna (Fig. S10b)—nistgħu nkunu kunfidenti li l-logħbiet SPACA6 identifikati x'aktarx ikunu preċiżi.
Preċedentement, PSI-BLAST fittxet il-cluster IZUMO1 bi tliet proteini oħra assoċjati mal-isperma: IZUMO2, IZUMO3 u IZUMO450.AlphaFold mbassar li dawn il-proteini tal-familja IZUMO jintewaw fid-dominju 4HB bl-istess mudell ta 'bonds ta' disulfide bħal IZUMO1 (Figuri 3a u S11), għalkemm m'għandhomx dominju bħal Ig.Huwa ipotetizzat li IZUMO2 u IZUMO3 huma proteini tal-membrana fuq naħa waħda simili għal IZUMO1, filwaqt li IZUMO4 jidher li huwa mnixxi.Il-funzjonijiet tal-proteini IZUMO 2, 3, u 4 fil-fużjoni tal-gameti ma ġewx determinati.IZUMO3 huwa magħruf li għandu rwol fil-bijoġenesi tal-akrożomi matul l-iżvilupp tal-isperma51 u nstab li l-proteina IZUMO tifforma kumpless50.Il-konservazzjoni tal-proteini IZUMO fil-mammiferi, rettili u anfibji tissuġġerixxi li l-funzjoni potenzjali tagħhom hija konsistenti ma 'dik ta' proteini oħra magħrufa assoċjati mal-fużjoni tal-gameti, bħal DCST1/2, SOF1 u FIMP.
Dijagramma tal-arkitettura tad-dominju tas-superfamilja IST, b'dominji 4HB, ċappetta, u simili għal Ig enfasizzati b'oranġjo, aħdar u blu, rispettivament.IZUMO4 għandu reġjun C-terminal uniku li jidher iswed.Rabtiet disulfide ikkonfermati u putattivi huma murija b'linji solidi u bit-tikek, rispettivament.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), u AlphaTMEM95 DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) jintwerew fl-istess firxa ta 'kuluri bħall-pannell A. Il-bonds tad-disulfide huma murija bil-maġenta.TMEM95, IZUMO2 u IZUMO3 transmembrane helices mhumiex murija.
B'differenza mill-proteina IZUMO, proteini SPACA oħra (jiġifieri, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, u SPACA9) huma maħsuba li huma strutturalment differenti minn SPACA6 (Fig. S12).SPACA9 biss għandu 4HB, iżda mhux mistenni li jkollu l-istess orjentazzjoni parallel-anti-parallel jew l-istess bond disulfide bħal SPACA6.SPACA1 biss għandu dominju simili bħal Ig.AlphaFold tbassar li SPACA3, SPACA4 u SPACA5 għandhom struttura kompletament differenti minn SPACA6.Interessanti, SPACA4 huwa magħruf ukoll li għandu rwol fil-fertilizzazzjoni, iżda sa punt akbar minn SPACA6, minflok jiffaċilita l-interazzjoni bejn l-isperma u l-oocyte zona pellucida52.
It-tfittxija tagħna AlphaFold sabet taqbila oħra għal IZUMO1 u SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, proteina transmembrana waħda speċifika għall-isperma, tagħmel il-ġrieden maskili infertili meta jitneħħew 32,33.Spermatozoa nieqsa TMEM95 kellhom morfoloġija normali, motilità, u l-abbiltà li jippenetraw iż-żona pellucida u jorbtu mal-membrana tal-bajd, iżda ma setgħux jingħaqdu mal-membrana tal-ooċiti.Studji preċedenti wrew li TMEM95 jaqsam xebh strutturali ma 'IZUMO133.Tabilħaqq, il-mudell AlphaFold ikkonferma li TMEM95 huwa 4HB bl-istess par ta 'motifi CXXC bħal IZUMO1 u SPACA6 u l-istess rabta disulfide addizzjonali bejn il-helizes 1 u 2 misjuba fi SPACA6 (Fig. 3a u S11).Għalkemm TMEM95 m'għandux dominju bħal Ig, għandu reġjun b'mudell ta 'bond disulfide simili għar-reġjuni taċ-ċappetta SPACA6 u IZUMO1 (Fig. 3b).Fiż-żmien tal-pubblikazzjoni ta 'dan il-manuskritt, is-server tal-preprint irrapporta l-istruttura ta' TMEM95, u kkonferma r-riżultat AlphaFold53.TMEM95 huwa simili ħafna għal SPACA6 u IZUMO1 u huwa kkonservat b'mod evoluttiv diġà fl-anfibji (Fig. 4 u S13).
It-tfittxija PSI-BLAST użat id-databases NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, u SOF1 biex tiddetermina l-pożizzjoni ta 'dawn is-sekwenzi fis-siġra tal-ħajja.Id-distanzi bejn il-punti tal-fergħat mhumiex murija fuq skala.
Ix-xebh strutturali ġenerali impressjonanti bejn SPACA6 u IZUMO1 jissuġġerixxi li huma membri fundaturi ta 'superfamilja strutturali kkonservata li tinkludi l-proteini TMEM95 u IZUMO 2, 3, u 4.membri magħrufa: IZUMO1, SPACA6 u TMEM95.Minħabba li ftit membri biss jippossjedu oqsma li jixbħu lil Ig, il-karatteristika tas-superfamilja IST hija d-dominju 4HB, li għandu karatteristiċi uniċi komuni għal dawn il-proteini kollha: 1) Coiled 4HB b'helizes rranġati f'alternazzjoni anti-parallel/parallel (Fig. . 5a), 2) il-qatta għandha wiċċ trijangolari li jikkonsisti f'żewġ helix fi ħdan il-mazz u t-tielet helix vertikali (Fig. żona ewlenija (Fig. 5c). Il-motif CXXC, misjub f'proteini simili għal thioredoxin, huwa magħruf li jiffunzjona. bħala sensor redox 54,55,56, filwaqt li l-motif fil-membri tal-familja IST jista 'jkun assoċjat ma' protein disulfide isomerases bħal ERp57 fil-fużjoni tal-gamete.Rwoli huma assoċjati 57,58.
Membri tas-superfamilja IST huma definiti minn tliet karatteristiċi karatteristiċi tad-dominju 4HB: erba 'helizes li jalternaw bejn orjentazzjoni parallela u antiparallel, uċuħ ba-trijangolari helical bundle, u motif doppju ca CXXC iffurmat bejn molekuli żgħar.) Helix N-terminali (oranġjo) u reġjun taċ-ċappetta β-hairpin (aħdar).
Minħabba x-xebh bejn SPACA6 u IZUMO1, ġiet ittestjata l-abbiltà ta' l-ewwel li jorbot ma' IZUMO1 jew JUNO.L-interferometrija tal-bijosaffi (BLI) hija metodu ta' rbit ibbażat fuq il-kinetika li qabel intuża biex tikkwantifika l-interazzjoni bejn IZUMO1 u JUNO.Wara l-inkubazzjoni tas-sensor bit-tikketta tal-bijotina b'IZUMO1 bħala lixka b'konċentrazzjoni għolja ta 'analite JUNO, ġie skopert sinjal qawwi (Fig. S14a), li jindika bidla indotta mill-irbit fil-ħxuna tal-bijomaterjal imwaħħal mal-ponta tas-sensor.Sinjali simili (jiġifieri, JUNO akkoppjat mas-sensor bħala lixka kontra l-analite IZUMO1) (Fig. S14b).L-ebda sinjal ma ġie skopert meta SPACA6 intuża bħala analit kontra IZUMO1 marbut mas-sensorju jew JUNO marbut mas-sensorju (Figura S14a, b).In-nuqqas ta 'dan is-sinjal jindika li d-dominju extraċellulari ta' SPACA6 ma jinteraġixxix mad-dominju extraċellulari ta 'IZUMO1 jew JUNO.
Minħabba li l-assaġġ BLI huwa bbażat fuq bijotinilazzjoni ta 'residwi ta' lisina ħielsa fuq il-proteina tal-lixka, din il-modifika tista 'tipprevjeni l-irbit jekk ir-residwi ta' lisina jkunu involuti fl-interazzjoni.Barra minn hekk, l-orjentazzjoni tal-irbit relattiv mas-sensorju tista 'toħloq xkiel steriku, għalhekk testijiet konvenzjonali ta' pull-down saru wkoll fuq l-ectodomains rikombinanti SPACA6, IZUMO1 u JUNO.Minkejja dan, SPACA6 ma ppreċipitax b'IZUMO1 bit-tikketta tiegħu jew JUNO bit-tikketta tiegħu (Fig. S14c, d), li jindika l-ebda interazzjoni konsistenti ma 'dak osservat fl-esperimenti BLI.Bħala kontroll pożittiv, aħna kkonfermajna l-interazzjoni ta 'JUNO b'tikketta tiegħu IZUMO1 (Figuri S14e u S15).
Minkejja x-xebh strutturali bejn SPACA6 u IZUMO1, l-inabbiltà ta 'SPACA6 li jorbot lil JUNO mhix sorprendenti.Il-wiċċ ta 'IZUMO1 uman għandu aktar minn 20 residwi li jinteraġixxu ma' JUNO, inklużi residwi minn kull wieħed mit-tliet reġjuni (għalkemm ħafna minnhom jinsabu fir-reġjun taċ-ċappetta) (Fig. S14f).Minn dawn ir-residwi, wieħed biss huwa kkonservat fi SPACA6 (Glu70).Filwaqt li ħafna sostituzzjonijiet ta 'fdalijiet żammew il-proprjetajiet bijokimiċi oriġinali tagħhom, ir-residwu essenzjali ta' Arg160 f'IZUMO1 ġie sostitwit mill-Asp148 iċċarġjat b'mod negattiv fi SPACA6;studji preċedenti wrew li l-mutazzjoni Arg160Glu f'IZUMO1 kważi tneħħi kompletament ir-rabta ma' JUNO43.Barra minn hekk, id-differenza fl-orjentazzjoni tad-dominju bejn IZUMO1 u SPACA6 żiedet b'mod sinifikanti l-erja tal-wiċċ tas-sit tal-irbit ta 'JUNO tar-reġjun ekwivalenti fuq SPACA6 (Fig. S14g).
Minkejja l-ħtieġa magħrufa għal SPACA6 għall-fużjoni tal-gameti u x-xebh tiegħu ma' IZUMO1, SPACA6 ma jidhirx li għandu funzjoni ta' rbit ta' JUNO ekwivalenti.Għalhekk, fittixna li ngħaqqdu d-dejta strutturali tagħna ma 'evidenza ta' importanza pprovduta mill-bijoloġija evoluttiva.L-allinjament tas-sekwenza tal-omologi ta' SPANA6 juri l-konservazzjoni tal-istruttura komuni lil hinn mill-mammiferi.Pereżempju, ir-residwi taċ-ċisteina huma preżenti anke f'anfibji relatati mill-bogħod (Fig. 6a).Bl-użu tas-server ConSurf, data ta 'żamma ta' allinjament ta 'sekwenza multipla ta' 66 sekwenza ġiet immappjata mal-wiċċ SPACA6.Dan it-tip ta 'analiżi jista' juri liema residwi ġew ikkonservati matul l-evoluzzjoni tal-proteini u jista 'jindika liema reġjuni tal-wiċċ għandhom rwol fil-funzjoni.
a Allinjament tas-sekwenza ta' ectodomains SPANA6 minn 12-il speċi differenti ppreparati bl-użu ta' CLUSTAL OMEGA.Skont l-analiżi tal-ConSurf, l-aktar pożizzjonijiet konservattivi huma mmarkati bil-blu.Ir-residwi taċ-ċisteina huma enfasizzati bl-aħmar.Il-konfini tad-dominju u l-elementi tal-istruttura sekondarja huma murija fil-parti ta 'fuq tal-allinjament, fejn il-vleġeġ jindikaw linji β u l-mewġ jindikaw helices.L-Identifikaturi tal-Aċċess tal-NCBI li fihom is-sekwenzi huma: bniedem (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), xadina kapuċċin (Cebus jimita, XP_017359366), żiemel (Equus caballus), killer (Equus leucophaeus, XP_011821277), żiemel (Equus caballus) XP_032_034) .), nagħaġ (Ovis aries, XP_014955560), iljunfant (Loxodonta africana, XP_010585293), kelb (Canis lupus familyis, XP_025277208), ġurdien (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (Sar1156381), Tasmanian devil (Sar11, XP_03), XP_03 8) , 61_89 u Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).In-numerazzjoni hija bbażata fuq l-ordni tal-bniedem.b Rappreżentazzjoni tal-wiċċ tal-istruttura SPACA6 b'4HB fin-naħa ta 'fuq u dominju simili Ig fil-qiegħ, kuluri bbażati fuq stimi ta' konservazzjoni mis-server ConSurf.L-aħjar partijiet ippreservati huma bil-blu, il-partijiet moderatament ippreservati huma bl-abjad, u l-inqas ippreservati huma bl-isfar.ċisteina vjola.Tliet garżi tal-wiċċ li juru livell għoli ta 'protezzjoni huma murija fl-irqajja' ttikkettjati 1, 2 u 3. Kartun 4HB jidher fil-parti ta' fuq tal-lemin (l-istess skema ta 'kulur).
L-istruttura SPACA6 għandha tliet reġjuni tal-wiċċ konservati ħafna (Fig. 6b).Garża 1 jifrex 4HB u r-reġjun taċ-ċappetta u fih żewġ pontijiet disulfide CXXC konservati, netwerk taċ-ċappetta Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), u tliet residwi aromatiċi ta 'barra kkonservati (Phe31, Tyr73, Phe137).rimm usa 'tad-dominju Ig-like (Fig. S6e), li jirrappreżenta diversi residwi ċċarġjati b'mod pożittiv fuq il-wiċċ tal-isperma.Interessanti, din il-garża fiha epitope ta 'antikorp li preċedentement intwera li jinterferixxi mal-funzjoni ta' SPACA6 30.Ir-Reġjun 3 jifrex fuq iċ-ċappetta u naħa waħda tad-dominju bħal Ig;dan ir-reġjun fih prolines konservati (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) u residwi polari/iċċarġjati li jħarsu 'l barra.B'mod sorprendenti, ħafna mir-residwi fuq il-wiċċ ta '4HB huma varjabbli ħafna (Fig. 6b), għalkemm it-tinja hija kkonservata matul l-omologu SPACA6 (kif indikat mill-konservatiżmu tal-qalba tal-gozz idrofobiku) u lil hinn mis-superfamilja IST.
Għalkemm dan huwa l-iżgħar reġjun f'SPACA6 bl-inqas elementi ta 'struttura sekondarja li jistgħu jinstabu, ħafna fdalijiet ta' reġjun taċ-ċappetta (inkluż ir-reġjun 3) huma kkonservati ħafna fost l-omologi ta 'SPACA6, li jistgħu jindikaw li l-orjentazzjoni tal-qatta helical u β-sandwich għandha rwol.bħala konservattiv.Madankollu, minkejja t-twaħħil estensiv tal-idroġenu u n-netwerks elettrostatiċi fir-reġjun taċ-ċappetta ta 'SPACA6 u IZUMO1, tista' tidher evidenza ta 'flessibilità intrinsika fl-allinjament tal-istrutturi multipli permessi ta' IZUMO137,43,44.L-allinjament ta 'l-oqsma individwali jikkoinċidu sew, iżda l-orjentazzjoni ta' l-oqsma relattiva għal xulxin varjat minn 50 ° sa 70 ° mill-assi ċentrali (Fig. S16).Biex tifhem id-dinamika konformazzjonali ta 'SPACA6 f'soluzzjoni, saru esperimenti SAXS (Fig. S17a, b).Ab initio rikostruzzjoni ta 'l-ectodomain SPACA6 konformi ma' struttura tal-kristall virga (Fig. S18), għalkemm il-plott Kratky wera xi grad ta 'flessibilità (Fig. S17b).Din il-konformazzjoni tikkuntrasta ma 'IZUMO1, li fiha l-proteina mhux marbuta tassumi forma ta' boomerang kemm fil-kannizzata kif ukoll fis-soluzzjoni43.
Biex tidentifika speċifikament ir-reġjun flessibbli, saret spettroskopija tal-massa ta 'skambju idroġenu-dewterju (H-DXMS) fuq SPACA6 u mqabbla ma' data miksuba qabel fuq IZUMO143 (Fig. 7a, b).SPACA6 huwa ċar aktar flessibbli minn IZUMO1, kif muri mill-iskambju ogħla tad-dewterju fl-istruttura kollha wara 100,000 s ta 'skambju.Fiż-żewġ strutturi, il-parti C-terminal tar-reġjun taċ-ċappetta turi livell għoli ta 'skambju, li probabbilment jippermetti rotazzjoni limitata ta' 4HB u oqsma simili għal Ig relattivi għal xulxin.Interessanti, il-parti C-terminal taċ-ċappetta SPACA6, li tikkonsisti mir-residwu 147CDLPLDCP154, hija reġjun 3 konservat ħafna (Fig. 6b), possibilment jindika li l-flessibbiltà interdomain hija karatteristika kkonservata b'mod evoluttiv ta 'SPACA6.Skont l-analiżi tal-flessibbiltà, id-dejta tat-tidwib termali tas-CD wriet li SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) hija inqas stabbli minn IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e u S19).
a immaġini H-DXMS ta 'SPACA6 u b IZUMO1.L-iskambju perċentwali tad-dewterju ġie ddeterminat fil-punti taż-żmien indikati.Il-livelli ta 'skambju idroġenu-dewterju huma indikati bil-kulur fuq skala gradjent minn blu (10%) għal aħmar (90%).Kaxxi suwed jirrappreżentaw oqsma ta 'skambju għoli.Il-konfini ta '4HB, ċappetta u dominju simili Ig osservati fl-istruttura tal-kristall huma murija fuq is-sekwenza primarja.Livelli ta 'skambju tad-dewterju f'10 s, 1000 s, u 100,000 s ġew impinġa fuq strixxa ta' grafika superimpost fuq l-uċuħ molekulari trasparenti ta 'SPACA6 u IZUMO1.Partijiet ta 'strutturi b'livell ta' skambju tad-dewterju taħt il-50% huma kkuluriti abjad.Żoni 'l fuq minn 50% ta' skambju H-DXMS huma kkuluriti fi skala gradjent.
L-użu ta 'CRISPR/Cas9 u strateġiji ġenetiċi ta' knockout tal-ġeni tal-ġrieden wassal għall-identifikazzjoni ta 'diversi fatturi importanti għat-twaħħil u l-fużjoni tal-isperma u l-bajd.Minbarra l-interazzjoni kkaratterizzata sew ta 'IZUMO1-JUNO u l-istruttura CD9, ħafna mill-proteini assoċjati mal-fużjoni tal-gameti jibqgħu strutturalment u funzjonalment enigmatika.Il-karatterizzazzjoni bijofiżika u strutturali ta 'SPACA6 hija biċċa oħra tal-puzzle molekulari ta' adeżjoni/fużjoni waqt il-fertilizzazzjoni.
SPACA6 u membri oħra tas-superfamilja IST jidhru li huma kkonservati ħafna fil-mammiferi kif ukoll fl-għasafar, rettili u anfibji individwali;fil-fatt, huwa maħsub li SPACA6 huwa saħansitra meħtieġ għall-fertilizzazzjoni f'zebrafish 59. Din id-distribuzzjoni hija simili għal proteini oħra magħrufa assoċjati mal-fużjoni tal-gameti bħal DCST134, DCST234, FIMP31, u SOF132, li jissuġġerixxi li dawn il-fatturi huma defiċjenti ta' HAP2 (ukoll magħrufa bħala GCS1) proteini li huma responsabbli għall-attività katalitika ta 'ħafna protisti., pjanti, u artropodi.Proteini tal-fużjoni fertilizzati 60, 61. Minkejja x-xebh strutturali qawwi bejn SPACA6 u IZUMO1, knockout ta 'ġeni li jikkodifikaw waħda minn dawn il-proteini rriżultaw f'infertilità fil-ġrieden maskili, li jindika li l-funzjonijiet tagħhom fil-fużjoni tal-gameti mhumiex duplikati..B'mod aktar ġenerali, l-ebda waħda mill-proteini tal-isperma magħrufa meħtieġa għall-fażi ta 'adeżjoni tal-fużjoni ma hija żejda.
Għadha mistoqsija miftuħa jekk SPACA6 (u membri oħra tas-superfamilja IST) jipparteċipawx f'junctions intergametic, jiffurmaw netwerks intragametiċi biex jirreklutaw proteini importanti għal punti ta 'fużjoni, jew forsi saħansitra jaġixxu bħala fusogens elużivi.Studji ta 'ko-immunopreċipitazzjoni fiċ-ċelloli HEK293T wrew interazzjoni bejn IZUMO1 tul sħiħ u SPACA632.Madankollu, l-ectodomains rikombinanti tagħna ma jinteraġixxux in vitro, li jissuġġerixxu li l-interazzjonijiet dehru f'Noda et al.it-tnejn tħassru fil-kostruzzjoni (innota d-denb ċitoplasmika ta 'IZUMO1, li ntwera li mhux meħtieġ għall-fertilizzazzjoni62).Alternattivament, IZUMO1 u/jew SPACA6 jistgħu jeħtieġu ambjenti speċifiċi li jorbtu li aħna ma nirriproduċux in vitro, bħal konformazzjonijiet fiżjoloġikament speċifiċi jew kumplessi molekulari li fihom proteini oħra (magħrufa jew għadhom mhux skoperti).Għalkemm l-ectodomain IZUMO1 huwa maħsub li jimmedja t-twaħħil tal-ispermatożoa mal-bajda fl-ispazju perivitelin, l-iskop tal-ectodomain SPACA6 mhuwiex ċar.
L-istruttura ta 'SPACA6 tiżvela diversi uċuħ konservati li jistgħu jkunu involuti f'interazzjonijiet proteina-proteina.Il-parti kkonservata tar-reġjun taċ-ċappetta immedjatament ħdejn il-motif CXXC (imsejjaħ Garża 1 hawn fuq) għandha bosta residwi aromatiċi li jħarsu 'l barra li ħafna drabi huma assoċjati ma' interazzjonijiet idrofobiċi u π-stacking bejn bijomolekuli.Il-ġnub wesgħin tad-dominju Ig-like (reġjun 2) jiffurmaw skanalatura ċċarġjata b'mod pożittiv b'Arg u residwi His konservati ħafna, u antikorpi kontra dan ir-reġjun intużaw qabel biex jimblukkaw il-fużjoni tal-gameti 30 .L-antikorp jirrikonoxxi l-epitope lineari 212RIRPAQLTHRGTFS225, li għandu tlieta mis-sitt residwi ta’ arginine u His220 kkonservat ħafna.Mhuwiex ċar jekk id-disfunzjoni hijiex minħabba l-imblukkar ta 'dawn ir-residwi speċifiċi jew ir-reġjun kollu.Il-post ta 'dan il-vojt ħdejn it-terminal C tas-sandwich β jindika interazzjonijiet cis mal-proteini tal-isperma ġirien, iżda mhux mal-proteini tal-ooċiti.Barra minn hekk, iż-żamma ta 'tħabbil b'ħafna proline flessibbli ħafna (sit 3) fi ħdan iċ-ċappetta tista' tkun is-sit ta 'interazzjoni proteina-proteina jew, aktar probabbli, tindika ż-żamma ta' flessibilità bejn iż-żewġ oqsma.Is-sess huwa importanti għar-rwol mhux magħruf ta' SPACA6.fużjoni tal-gameti.
SPACA6 għandu proprjetajiet ta 'proteini ta' adeżjoni interċellulari, inklużi β-sandwiches bħal Ig.Ħafna proteini adeżivi (eż., cadherins, integrins, adhesiins, u IZUMO1) għandhom qasam β-sandwich wieħed jew aktar li jestendu proteini mill-membrana taċ-ċellula għall-miri ambjentali tagħhom63,64,65.Id-dominju bħal Ig ta 'SPACA6 fih ukoll motif li jinsab komunement f'sandwiches β ta' adeżjoni u koeżjoni: doublets ta 'linji paralleli fit-truf ta' β-sandwiches, magħrufa bħala klampi mekkaniċi66.Huwa maħsub li dan il-motif iżid ir-reżistenza għall-forzi ta 'shear, li huwa ta' valur għall-proteini involuti f'interazzjonijiet interċellulari.Madankollu, minkejja din ix-xebh mal-adhesins, bħalissa m'hemm l-ebda evidenza li SPACA6 jinteraġixxi mal-abjad tal-bajd.L-ectodomain SPACA6 ma jistax jorbot ma 'JUNO, u ċ-ċelloli HEK293T li jesprimu SPACA6, kif muri hawn, bilkemm jinteraġixxu ma' ooċiti nieqsa miż-żona 32.Jekk SPACA6 jistabbilixxi rabtiet intergametiċi, dawn l-interazzjonijiet jistgħu jeħtieġu modifiki wara t-traduzzjoni jew jiġu stabbilizzati minn proteini oħra tal-isperma.B'appoġġ għal din l-aħħar ipoteżi, l-ispermatozoa defiċjenti ta' IZUMO1 jorbtu ma' ooċiti, u juru li molekuli oħra għajr IZUMO1 huma involuti fil-pass ta' adeżjoni tal-gameti 27 .
Ħafna proteini tal-fużjoni virali, ċellulari, u tal-iżvilupp għandhom proprjetajiet li jbassru l-funzjoni tagħhom bħala fusoġeni.Pereżempju, glikoproteini tal-fużjoni virali (klassijiet I, II u III) għandhom peptide jew loop tal-fużjoni idrofobika fit-tarf tal-proteina li tiddaħħal fil-membrana ospitanti.Il-mappa tal-idrofiliċità ta 'IZUMO143 u l-istruttura (determinata u prevista) tas-superfamilja IST ma wrew l-ebda peptide ta' fużjoni idrofobika apparenti.Għalhekk, jekk xi proteini fis-superfamilja IST jiffunzjonaw bħala fusogens, jagħmlu dan b'mod differenti minn eżempji magħrufa oħra.
Bħala konklużjoni, il-funzjonijiet tal-membri tas-superfamilja IST ta 'proteini assoċjati mal-fużjoni tal-gameti jibqgħu misteru tantalizing.Il-molekula rikombinanti tagħna SPACA6 ikkaratterizzata u l-istruttura riżolta tagħha se jipprovdu ħarsa lejn ir-relazzjonijiet bejn dawn l-istrutturi kondiviżi u r-rwol tagħhom fit-twaħħil u l-fużjoni tal-gameti.
Is-sekwenza tad-DNA li tikkorrispondi għall-ectodomain SPACA6 uman imbassar (numru ta 'adeżjoni NCBI NP_001303901.1; residwi 27-246) ġiet ottimizzata bil-kodon għall-espressjoni fiċ-ċelloli Drosophila melanogaster S2 u sintetizzata bħala framment tal-ġene bis-sekwenza li tikkodifika Kozak (Eurofin)., is-sinjal ta 'sekrezzjoni BiP u t-truf korrispondenti 5′ u 3′ għal klonazzjoni indipendenti mill-ligazzjoni ta' dan il-ġene f'vettur ta 'espressjoni pMT ibbażat fuq promotur ta' metallothionein modifikat għall-għażla b'puromycin (pMT-puro).Il-vettur pMT-puro jikkodifika sit tal-qsim tat-trombina segwit minn tikketta 10x-His C-terminal (Figura S2).
It-trasfezzjoni stabbli tal-vettur SPACA6 pMT-puro f'ċelluli D. melanogaster S2 (Gibco) saret b'mod simili għall-protokoll użat għal IZUMO1 u JUNO43.Iċ-ċelloli S2 ġew imdewweb u mkabbra fil-medja ta 'Schneider (Gibco) supplimentat b'konċentrazzjoni finali ta' 10% (v/v) serum tal-għoġol tal-fetu inattivat bis-sħana (Gibco) u antibijotiku antimikotiku 1X (Gibco).Ċelloli ta 'passaġġ bikri (ċelluli 3.0 x 106) ġew ibbanjati fi bjar individwali ta' pjanċi ta '6-well (Corning).Wara 24 siegħa ta 'inkubazzjoni f'27 ° C, iċ-ċelloli ġew trasfettati b'taħlita ta' 2 mg tal-vettur SPACA6 pMT-puro u reaġent ta 'trasfezzjoni Effectene (Qiagen) skont il-protokoll tal-manifattur.Ċelloli trasfettati ġew inkubati għal 72 siegħa u mbagħad maħsuda b'6 mg/ml puromicin.Iċ-ċelloli mbagħad ġew iżolati minn medju Schneider komplut u mqiegħda f'mezz Insect-XPRESS ħieles minn serum (Lonza) għall-produzzjoni ta 'proteini fuq skala kbira.Lott ta '1 L ta' kultura ta 'ċelluli S2 tkabbar għal ċelluli 8-10 × 106 ml-1 f'kunjett Erlenmeyer tal-polypropylene b'qiegħ ċatt ventilat ta' 2 L u mbagħad sterilizzat b'konċentrazzjoni finali ta '500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) u sterilizzat ffiltrat.indott.Il-kulturi indotti ġew inkubati f'27 ° C f'120 rpm għal erbat ijiem.
Mezz kondizzjonat li fih SPACA6 ġie iżolat permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'5660 × g f'4 ° C segwit minn sistema ta' filtrazzjoni tanġenzjali ta 'fluss Centramate (Pall Corp) b'membrana MWCO ta' 10 kDa.Applika medium ikkonċentrat li fih SPACA6 għal kolonna ta' 2 ml Ni-NTA agarose resin (Qiagen).Ir-reżina Ni-NTA ġiet maħsula b'10 volumi ta 'kolonna (CV) ta' buffer A u mbagħad 1 CV ta 'buffer A ġiet miżjuda biex tagħti konċentrazzjoni finali ta' imidazole ta '50 mM.SPACA6 ġie eluwit b'10 ml ta' buffer A supplimentat b'imidazole għal konċentrazzjoni finali ta' 500 mM.Trombina tal-klassi ta 'restrizzjoni (Millipore Sigma) ġiet miżjuda direttament mat-tubi tad-dijalisi (MWCO 12-14 kDa) f'unità 1 għal kull mg SPACA6 vs 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 u 150 mM NaCl (buffer B) għad-dijalisi.) f'4°C għal 48 siegħa.L-SPACA6 imnaqqas bit-trombina ġie mbagħad dilwit tliet darbiet biex titnaqqas il-konċentrazzjoni tal-melħ u mgħobbija fuq kolonna ta 'skambju ta' katjoni MonoS 5/50 GL ta '1 ml (Cytiva/GE) ekwilibrata b'10 mM Tris-HCl, pH 7.5.L-iskambjatur tal-katjoni ġie maħsul bi 3 CV ta '10 mM Tris-HCl, pH 7.5, imbagħad SPACA6 ġie eluwit bi gradjent lineari ta' 0 sa 500 mM NaCl f'10 mM Tris-HCl, pH 7.5 għal 25 CV.Wara kromatografija ta' skambju joniku, SPACA6 kien ikkonċentrat għal 1 ml u eluwit b'mod iżokratiku minn kolonna ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ekwilibrata b'buffer B. Skont il-kromatogramma, agħlaq u konċentrat frazzjonijiet li fihom SPACA6.Il-purità kienet ikkontrollata b'elettroforeżi mtebbgħin b'Coomassie fuq ġel SDS-polyacrylamide ta' 16%.Il-konċentrazzjoni tal-proteina ġiet ikkwantifikata bl-assorbiment f'280 nm bl-użu tal-liġi Beer-Lambert u l-koeffiċjent teoretiku tal-estinzjoni molari.
SPACA6 purifikat ġie djalizzat matul il-lejl kontra 10 mM fosfat tas-sodju, pH 7.4 u 150 mM NaF u dilwit għal 0.16 mg/mL qabel l-analiżi bi spettroskopija CD.Skennjar spettrali ta 'CDs b'wavelength ta' 185 sa 260 nm inġabar fuq spettropolarimetru Jasco J-1500 bl-użu ta 'kuvettes tal-kwarz b'tul ta' passaġġ ottiku ta '1 mm (Helma) f'25 ° C b'rata ta' 50 nm / min.L-ispettri tas-CD ġew ikkoreġuti fil-linja bażi, b'medja fuq 10 akkwisti, u kkonvertiti għal ellittiċità residwa medja (θMRE) fi gradi cm2/dmol:
fejn MW huwa l-piż molekulari ta' kull kampjun f'Da;N huwa n-numru ta 'aċidi amminiċi;θ hija l-ellittiċità f'milligradi;d jikkorrispondi għat-tul tal-mogħdija ottika f'ċm;konċentrazzjoni tal-proteina f'unitajiet.