310 10 * 1mm Stainless steel coiled tubing komponent kimiku, Id-dominji N-terminali ta 'spidroin jiffurmaw idroġels ibbażati fuq fibri amilojdi u jipprovdu pjattaforma għall-immobilizzazzjoni tal-proteini.

Grazzi talli żort Nature.com.Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Sliders li juru tliet artikoli għal kull slide.Uża l-buttuni ta 'wara u li jmiss biex timxi permezz tal-pjastri, jew il-buttuni tal-kontrollur tas-slajds fl-aħħar biex tiċċaqlaq minn kull slide.

Speċifikazzjoni

310 10 * 1mm Stainless steel coiled tubi fornituri

Kompożizzjoni Kimika

Proprjetajiet Mekkaniċi

Proteini tal-ħarir tal-brimba rikombinanti (proteini tal-ħarir tal-brimba) għandhom ħafna applikazzjonijiet potenzjali fl-iżvilupp ta 'bijomaterjali ġodda, iżda n-natura multimodali u suxxettibbli għall-aggregazzjoni tagħhom tagħmilhom diffiċli biex jinkisbu u faċli biex jintużaw.Hawnhekk nirrapportaw li proteini spidroin minjatura rikombinanti u, importanti, id-dominju N-terminal (NT) innifsu jifformaw malajr idroġels li jsostnu lilhom infushom u trasparenti f'37 °C.proteini tal-fużjoni li jikkonsistu f'NT u proteina fluworexxenti ħadra jew purine nucleoside phosphorylase jiffurmaw proteini tal-fużjoni kompletament funzjonali.Idroġels.Ir-riżultati tagħna juru li l-NT rikombinanti u l-proteini tal-fużjoni jipprovdu rendimenti ta 'espressjoni għolja u jagħtu idroġels bi proprjetajiet attraenti bħal trasparenza, ġelazzjoni mingħajr crosslinking, u immobilizzazzjoni diretta ta' proteini attivi f'densità għolja.
Brimb għandhom daqs seba 'settijiet differenti ta' glandoli tal-ħarir, kull wieħed jipproduċi tip speċifiku ta 'ħarir.Is-seba' speċi tal-ħarir kollha huma komposti minn proteini tal-ħarir tal-brimba (spidroins) tul madwar 6000 residwi u fihom reġjun ripetut kbir ċentrali mdawwar b'dominji sferiċi N- u C-terminal (NT u CT)1,2.L-aktar tip ta 'ħarir studjat, l-ampulla primarja, hija prodotta mill-glandola tal-ampulla primarja.F'din il-glandola, monosaff ta 'ċelluli epiteljali jissintetizza proteini spidroin u tnixxihom fil-lumen tal-glandola, fejn huma preżenti f'forma solubbli (doping) f'konċentrazzjonijiet estremament għoljin (30-50% w/v)3,4.L-organizzazzjoni u l-konformazzjoni tal-proteini spidroin ampullari ewlenin fil-glandola ġew diskussi, iżda l-biċċa l-kbira tal-evidenza sperimentali tindika l-preżenza ta 'konformazzjoni elikali ġeneralment elikali u/jew każwali u strutturi micellari jew lamellari5,6,7,8,9,10.Filwaqt li l-oqsma ripetittivi jirregolaw il-proprjetajiet mekkaniċi tal-fibri tal-ħarir, li jiffurmaw nanokristalli β-sheet u strutturi amorfi11,12,13,14,15, id-dominji finali jirregolaw il-fibri tal-ħarir b'reazzjoni għall-kundizzjonijiet li jinbidlu tul il-glandola tal-ħarir16,17,18.Billi tikkontrolla l-formazzjoni tal-ħarir, 19. Id-dominji terminali huma kkonservati b'mod evoluttiv u l-funzjoni tagħhom tista 'tkun komuni għall-proteini spidroin kollha 2,20,21.Matul il-mogħdija mill-glandola, il-pH ta 'spidroin jonqos minn madwar 7.6 għal < 5.716 u jiżdied b'shear u stretch medjat mill-moviment permezz tal-katusa li tidjieq gradwalment.F'soluzzjoni, CT huwa dimeru parallel kostituttiv α-helical17, iżda b'reazzjoni għal forzi baxxi ta 'pH u shear, CT tiżvolġi u taqleb β-layers16, 17, possibbilment iqanqal β-saffi fir-reġjuni ripetittivi ta' Convert 16. NT huma monomeriċi taħt kundizzjonijiet li jirriflettu l-kundizzjonijiet fil-lumen tal-glandola u jimmedjaw is-solubilità ta 'spidroin, iżda f'pH imnaqqas, il-protonazzjoni ta' numru ta 'ktajjen tal-ġenb tal-aċidu karbossiliku twassal għal dimerizzazzjoni ta' NT b'pKa ta 'madwar 6.5, u b'hekk tistabbilizza NT u tiffissa spidroin fil-kbar kwantitajiet.netwerks16,18.Għalhekk, NT għandu rwol ewlieni fil-formazzjoni tal-filament, li jinbidel minn monomeru fil-kisi għal dimer fil-fibra23,24,25.NT jibqa 'solubbli ħafna u helical taħt il-kundizzjonijiet kollha studjati sal-lum16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, li ispiraw l-iżvilupp tiegħu bħala tikketta li ttejjeb is-solubilità għall-produzzjoni ta' proteini eteroloġi.
Proteina tal-ħarir tal-brimba mini rikombinanti, li tikkonsisti minn NT wieħed, reġjun wieħed ripetut ripetut, CT wieħed, u tikketta His6 (His-NT2RepCT) għall-purifikazzjoni, hija solubbli f'buffer milwiema daqs proteina nattiva tal-ħarir tal-brimba u timita karatteristiċi indiġeni importanti tal-brimba tal-ħarir .kopertura 25.31.His-NT2RepCT jista 'jiġi mibrum f'fibri kontinwi bl-użu ta' magna bijomimetika li fiha kisi solubbli ta 'pH 8 jiġi estruż f'banju ta' l-ilma ta 'pH 525,32,33,34,35.Il-fermentazzjoni tal-bijoreattur ta 'E. coli li tesprimi His-NT2RepCT u wara t-trattament sussegwenti rriżultat f'rendiment > 14 g/L wara purifikazzjoni.Ir-rendiment għoli, is-solubilità għolja, u r-rispons adegwat ta 'His-NT2RepCT għal kundizzjonijiet aċidużi huma kollha attribwiti għal NT23, 25, 34.
Hawnhekk nirrapportaw il-formazzjoni mgħaġġla ta 'hydrogels trasparenti minn proteini spidroin rikombinanti, inkluż NT waħdu, billi inkubaw soluzzjoni ta' proteina f'37 °C.Bl-użu tal-fluworexxenza thioflavin T (ThT), l-ispettroskopija infra-aħmar tat-trasformazzjoni ta’ Fourier (FTIR), l-ispettroskopija ta’ reżonanza manjetika nukleari (NMR) u l-mikroskopija elettronika ta’ trażmissjoni (TEM), sibna li l-proteini NT u microspider jgħaddu minn trasformazzjoni strutturali f’folji β u fibri li jixbħu l-amilojdi meta jiġu ffurmati ġellijiet.Barra minn hekk, proteini ta 'fużjoni ta' NT u proteina fluworexxenti ħadra (GFP) jew purine nucleoside phosphorylase (PNP) jiffurmaw idroġels bi frammenti ta 'fużjoni kompletament funzjonali.Espressjoni ta 'rendiment għoli f'ospiti eteroloġi, flimkien ma' formazzjoni rapida ta 'idroġels taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi, tiftaħ il-possibbiltà ta' produzzjoni kosteffettiva ta 'idroġels b'funzjonijiet ta' inġinerija.
B'differenza mill-biċċa l-kbira tal-proteini spidroin rikombinanti rrappurtati36, His-NT2RepCT huwa stabbli fil-buffer Tris-HCl f'pH 8 u jista 'jiġi kkonċentrat sa 500 mg/mL mingħajr preċipitazzjoni25.Għalhekk, konna sorpriżi li sibna li din il-proteina malajr tifforma hydrogels ottikament ċari u li jsostnu lilhom infushom meta tkun inkubata f'37 ° C (Fig. 1b-d).Studji ulterjuri wrew li l-ġelazzjoni His-NT2RepCT seħħet fuq firxa wiesgħa ta 'konċentrazzjonijiet ta' proteini (10-300 mg / mL) u li din il-konċentrazzjoni kienet inversament korrelata mal-ħin ta 'ġelazzjoni (Fig. 1c u Fig. 1 Supplimentari).Biex issir taf liema partijiet ta 'His-NT2RepCT jimmedjaw il-formazzjoni ta' idroġel, imbagħad eżaminajna kull dominju individwalment u f'kombinazzjonijiet varji bl-użu ta 'assaġġ ta' inverżjoni tal-garafina (Figura 1a, b).Il-frazzjonijiet kollha ttestjati ta 'spidroin rikombinanti ffurmaw ġellijiet (f'konċentrazzjoni ta' proteina ta '300 mg / mL) f'inqas minn siegħa, ħlief għal 2Rep preċipitat (Fig. 1b).Dan jissuġġerixxi li NT u CT waħedhom, flimkien, jew assoċjati ma 'repetizzjonijiet, jistgħu ġell f'37 ° C u li t-tikketta His6 ma taffettwax dan il-proċess sa ċertu punt sinifikanti.Minħabba l-idea komuni li NT hija proteina li tinħall ħafna u stabbli, u li rapporti preċedenti ta 'hydrogels spidroin rikombinanti attribwixxu effetti ta' ġelazzjoni għal bidliet konformazzjonali f'reġjuni ripetuti u/jew CTs, NT innifsu jista '.L-iskoperta tal-ġelazzjoni kienet mhux mistennija.Tabella Supplimentari 1) 37, 38, 39. B'mod notevoli, NT diġà ġelled fi żmien 10 minuti f'konċentrazzjoni ta '≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Esperimenti ta 'inverżjoni tal-kunjett b'diversi konċentrazzjonijiet ta' NT wrew li f'> 50 mg/mL is-soluzzjoni NT ġelled aktar malajr minn His-NT2RepCT fil-konċentrazzjoni korrispondenti (w/v, Figura 1c).
Rappreżentazzjoni skematika ta 'diversi kostruzzjonijiet ta' spidroin studjati f'dan ix-xogħol.b Ħin tal-ġel f'37 °C għal diversi proteini spidroin rikombinanti (300 mg/mL) ivverifikati billi taqleb il-kunjett.Ġell CT immedjatament mingħajr inkubazzjoni (<300 mg/mL), 2Rep preċipitati (300 mg/mL, skala 5 mm).c Ħin tal-ġel ta' His-NT2RepCT u NT f'konċentrazzjonijiet ta' proteini indikati f'37°C.d Ritratti ta 'His-NT2RepCT u NT hydrogels bil-brimba u l-ittra "NT" stampati taħt, rispettivament (it-tnejn 200 mg/mL, skala bar 5 mm).
Hydrogels iffurmati minn diversi proteini spidroin rikombinanti għandhom kuluri kemmxejn differenti, u l-osservazzjoni b'għajnejk mikxufa turi gradi differenti ta 'trasparenza (Fig. 1b).Ġellijiet NT huma eċċezzjonalment ċari filwaqt li ġellijiet oħra jsiru opaki.Ġellijiet His-NT2RepCT u NT mitfugħa f'tubi ċilindriċi jistgħu jitneħħew mill-moffa intatta (Fig. 1d).
Biex jiġi ttestjat jekk il-kisi tal-ħarir tal-brimba naturali ġel taħt kundizzjonijiet li issa nstabu li jikkawżaw ġelazzjoni tal-proteini spidroin rikombinanti, inġabru kisjiet mill-glandola ampulla kbira tal-brimba tal-pont Svediża (Larinioides sclopetarius).Il-kisi nħażen f'20 mM Tris-HCl buffer f'50 mg/mL (ibbażat fuq il-piż niexef imkejjel), iżda ma ġiet osservata l-ebda ġelazzjoni matul l-inkubazzjoni ta '21 jum f'37 °C (Figura 2a Supplimentari).
Biex tikkwantifika dawn il-ġellijiet, jista 'jintuża kejl reoloġiku biex jiġi studjat il-proċess ta' ġelazzjoni u jiddetermina l-proprjetajiet mekkaniċi ġenerali.B'mod partikolari, il-monitoraġġ tal-modulu tal-ħażna (elastiċità) f'temperaturi elevati jista 'jipprovdi informazzjoni dwar it-temperatura tal-ġelu kif ukoll il-proprjetajiet viscoelastiċi tal-kisi.Esperimenti ta 'żieda fit-temperatura (bl-użu ta' 1 ° C / min f'25-45 ° C, ibbażati fuq studji preċedenti li jużaw soluzzjonijiet tal-ħażniet tal-ħarir naturali)40,41 urew li l-moduli tal-ħażna tas-soluzzjonijiet His-NT2RepCT u NT żdiedu maż-żieda fit-temperatura.żdiedet (Fig. 2 u Supplimentari Fig. 3).Notevolment, il-modulu NT beda jikber f'temperatura aktar baxxa meta mqabbel ma 'His-NT2RepCT, konsistenti mal-ħin tal-ġell aktar mgħaġġel osservat meta NT kien inkubat direttament ma' His-NT2RepCT f'37 ° C (Figura 1).Wara tnaqqis sussegwenti fit-temperatura, il-modulu tal-ħażna ma rritornax għal valuri aktar baxxi u baqa 'fuq il-modulu tat-telf (ara Fig. 3 Supplimentari), li jindika ġelazzjoni stabbli termalment irriversibbli.Wara l-ġelazzjoni, il-modulu elastiku finali varja minn 15 sa 330 kPa għall-idroġels His-NT2RepCT f'konċentrazzjoni ta '100-500 mg/mL, u l-modulu elastiku finali għall-idroġels NT (100-500 mg/mL) varja minn 2 sa 1400 kPa (Fig. , 2 u dejta tar-rampa kompluta) ara Fig. 3 Supplimentari).
a Bidla fit-temperatura waqt il-kejl ta' His-NT2RepCT (300 mg/mL) u b NT (300 mg/mL) bi tħawwad.Il-vleġeġ jindikaw ix-xejra tat-temperatura, u l-isfumatura eħfef tad-dejta tal-modulu tal-ħażna turi ttestjar f'valuri ta 'torque aktar baxxi għall-istrument milli speċifikat mill-manifattur, li hija l-kawża taż-żieda fil-ħoss.c Akkumulazzjoni tal-modulu aħħari ta' His-NT2RepCT u NT wara temperatura elevata (100, 300, u 500 mg/mL).Il-qari kollu tal-modulu jittieħed bi frekwenza ta' 0.1 Hz.
Bħala metodu potenzjali għall-investigazzjoni ta 'bidliet konformazzjonali assoċjati mal-ġelazzjoni, irreġistrajna l-ispettri FTIR ta' His-NT2RepCT u NT qabel u wara l-ġelazzjoni f'37 ° C (Figura 3a, b).Kif mistenni, l-ispettri tas-soluzzjonijiet His-NT2RepCT u NT kienu jikkorrispondu ma 'proteini li juru struttura sekondarja α-helix/coil każwali, b'medda ppronunzjata f'1645 cm-1.Għaż-żewġ idroġels, il-ġelazzjoni rriżultat fil-formazzjoni ta 'żewġ dirgħajn fin-nofs I band f'madwar 1617 cm-1 u 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), li jindika l-formazzjoni ta' strutturi antiparalleli β-sheet.Dawn il-bidliet jistgħu wkoll jidhru b'mod ċar fl-ispettri rispettivi tat-tieni derivattiva u tal-ġelazzjoni tad-differenza (Fig. 4b Supplimentari).Iż-żewġ meded tas-saff NT β kienu aktar evidenti minn dawk ta 'His-NT2RepCT, li jindikaw li l-kontenut totali tal-meded tas-saff β fl-idroġel NT kien ogħla minn dak tal-idroġel NT2RepCT.
a spettri ta 'assorbiment FTIR ta' His-NT2RepCT u b NT (it-tnejn 500 mg/mL) qabel (soluzzjoni) u wara (ġel) inkubazzjoni f'37°C.c Immaġini TEM ta 'ġellijiet NT2RepCT sospiżi mill-ġdid ta' 50 mg/ml u d NT.Skala bar 200 nm.e Dijametri tal-fibra ta 'hydrogels His-NT2RepCT u NT.n = 100 fibri mkejla, p < 0.0001.Il-vireg tal-iżball juru d-devjazzjoni standard.Iċ-ċentru tal-vireg tal-iżball huwa l-medja.Intuża t-test mhux imqabbad (żewġ denbu) għall-analiżi statistika.f ThT fluworexxenza ta 'diversi proteini spidroin rikombinanti (100 mg/mL) f'37 °C mingħajr tħawwad.g NT (100 mg/mL) esperimenti ta' inokulazzjoni minn ġel NT 100 mg/mL b'0%, 5%, 10%, u 20% żerriegħa.
Analiżi tal-ġell bl-użu ta 'mikroskopija elettronika ta' trażmissjoni (TEM) uriet li l-idroġel jikkonsisti f'fibrili bħal amilojdi (Figuri 3c, 3d).Il-fibri ffurmati minn NT kienu tawwalija (5-12 nm fid-dijametru) u mhux ramifikati, filwaqt li l-fibrils His-NT2RepCT kienu iqsar fit-tul u b'mod sinifikanti usa 'f'dijametru (7-16 nm) (Fig. 3e).Dawn ir-riżultati ppermettewna nsegwu l-kinetika tal-fibrożi bl-użu tal-assaġġ thioflavin T (ThT).Għall-proteini spidroin rikombinanti kollha, is-sinjal fluworexxenti żdied meta l-kampjuni ġew inkubati f'37 °C (Fig. 3f, Fig. Supplimentari 5a).B'mod konsistenti ma 'din is-sejba, eżami mikroskopiku ta' NT u His-NT2RepCT taħt kundizzjonijiet ta 'ġelling wera żieda uniformi fil-fluworexxenza ThT mingħajr akkumulazzjoni lokali notevoli ta' aggregati ThT-pożittivi (Fig. Supplimentari 5b, c).Il-formazzjoni ta 'fibrili ThT-pożittivi ma kinitx akkumpanjata minn żieda fit-turbidità NT u His-NTCT (Fig. 5d Supplimentari), li jfisser li netwerk ta' fibri fil-ġell jista 'jifforma mingħajr ma jikkomprometti ċ-ċarezza tal-ġel.Iż-żrigħ billi żżid ammonti żgħar ta 'fibri ffurmati minn qabel jista' jaċċellera b'mod sinifikanti l-formazzjoni ta 'fibri ta' xi amyloids42,43,44 iżda żżid 5%, 10% jew 20% (w/w) NT għal soluzzjoni ta 'hydrocoagulants NT.effett taż-żrigħ (Fig. 3g).Forsi dan huwa dovut għall-fatt li l-fibrils fl-idroġel huma relattivament fissi u ma jistgħux jintużaw bħala żrieragħ.
L-imġieba mhux mistennija ta 'proteini spidroin rikombinanti f'temperaturi għoljin wassal għal aktar studji ta' spettroskopija ta 'reżonanza manjetika nukleari (NMR) biex jidentifikaw bidliet konformazzjonali assoċjati mal-formazzjoni tal-ġel.L-ispettri NMR tas-soluzzjonijiet His-NT2RepCT irreġistrati matul iż-żmien f'37 ° C urew li CT kien għadu parzjalment mitwi, filwaqt li s-sinjali NT u 2Rep kienu sparixxew (Fig. 4a), li jissuġġerixxu li kien prinċipalment NT u 2Rep li l-formazzjoni parzjalment ikkontrollata ta 'His- NT2RepCT idroġel.Is-sinjal CT kien ukoll attenwat għal 20% tal-intensità oriġinali tiegħu, li jissuġġerixxi li CT huwa wkoll l-aktar iffissat u inkorporat fl-istruttura tal-idroġel.Għal porzjon iżgħar tas-CT, li huwa mobbli daqs fil-kampjun preinkubat u għalhekk osservat permezz ta 'soluzzjoni NMR, l-ispettri m'għandhomx sinjali għall-ewwel 10 residwi strutturati, possibbilment minħabba immobilizzazzjoni diffiċli tal-porzjon mehmuż ta' His-NT2Rep.L-ispettri NMR ta 'l-istat ta' idroġels -NT2RepCT żvelaw il-preżenza predominanti ta 'α-helizes u β-saffi u, sa ċertu punt, il-konformazzjoni tal-coil każwali (Fig. 4b).L-analiżi tal-bidla kimika tar-residwi tal-methionine preżenti biss f'NT uriet li dan id-dominju kien ikkonvertit fi struttura β-sheet.L-ispettri li jiddependu mill-ħin ta 'NT fis-soluzzjoni wrew tnaqqis uniformi fl-intensità tas-sinjal (Fig. 4c), u NMR ta' stat solidu ta 'hydrogels NT wera li ħafna mir-residwi NT ġew konvertiti fi strutturi β-sheet (Fig. 4d).Il-konformazzjoni ta '2Rep ma setgħetx tiġi ddeterminata separatament minħabba t-tendenza tagħha li tiġbor.Madankollu, l-ispettri tal-NMR tal-istat solidu tal-idroġels NTCT u His-NT2RepCT dehru simili ħafna (Fig. 4b; Fig. Supplimentari 6b), li jissuġġerixxu li 2Rep kkontribwixxa ftit għall-parti strutturali tal-idroġel His-NT2RepCT.Għal idroġels CT, instabu li jeżistu α-helizes, β-sheets u strutturi sekondarji helical każwali (Figura 6d Supplimentari).Dan jissuġġerixxi li xi partijiet tas-CT jibqgħu α-helizes filwaqt li oħrajn isiru β-sheets.Għalhekk, ir-riżultati tal-ispettroskopija NMR jissuġġerixxu li NT huwa importanti għall-formazzjoni tal-idroġel u jittrasforma wkoll f'konformazzjoni β-sheet mal-fużjoni ma '2Rep u CT.B'konsistenza ma 'dan, reċentement sibna li żippijiet spazjali amyloid x'aktarx jiffurmaw fil-ħames helix tad-dominju NT, u l-algoritmu Waltz mbassar reġjun amilojdoġeniku fil-helix 1 (Fig. 4e).
Spettri 2D ta 'soluzzjoni 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT qabel (blu) u 19-il siegħa wara l-inkubazzjoni (aħmar) f'37°C.Il-qċaċet inkroċjati individwali fl-ispettru aħmar u F24, G136, polyA fl-ispettru blu huma indikati b'simboli ta' aċidu amminiku b'ittra waħda u numri tar-residwi.L-insets juru d-dipendenza tal-intensità tas-sinjal fil-ħin għal residwi magħżula mid-dominji NT, 2Rep, u CT.b Spettri ta' frekwenza tar-radju fi stat solidu (RFDR) ta' idroġels His-NT2RepCT.Korrelazzjonijiet tar-residwi Cα/Cβ osservati fl-ispettri RFDR ġew determinati b'paragun ma' mudell kimiċi ta' peptidi u valuri derivati ​​mill-istatistika82,83 u l-istrutturi sekondarji tagħhom.SSB – faxxa tal-ġenb li ddur.c Spettri ta' dimensjoni waħda ta' soluzzjoni 15N-HSQC 10 mg/mL NT waqt inkubazzjoni f'37 °C għal 36 siegħa.Id-daħla turi l-intensità volumetrika kontra l-ħin.d Spettri RFDR ta' stat solidu ta' NT hydrogels.Il-korrelazzjonijiet tar-residwi Cα/Cβ u l-istrutturi sekondarji tagħhom osservati fl-ispettri RFDR huma indikati.e Ibbażat fuq il-profil tal-propensità tal-fibrillazzjoni NT45.79 mid-database Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).L-enerġija Rosetta tat-tieqa tal-bidla tas-sajjetti spazjali tal-hexapeptide hija murija f'kcal/mol.Il-vireg ħomor jindikaw hexapeptides bi propensità għolja ta' fibrożi (enerġija Rosetta taħt -23 kcal/mol; taħt il-linja bit-tikek).Il-vireg ħodor jindikaw frammenti b'enerġiji Rosetta 'l fuq mil-limitu u għalhekk inqas probabbli li jiffurmaw żippijiet steriċi.Frammenti li fihom il-prolina ġew esklużi mill-analiżi (mingħajr kolonni).Il-kwadri jindikaw żoni ta 'amilojdożi mbassra mill-algoritmu Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Is-sekwenza tar-residwi ta 'l-aċidu amminiku ta' NT tinsab fil-quċċata, u t-tipi ta 'residwi misjuba fl-istruttura sekondarja β (determinata minn spettroskopija NMR ta' stat solidu) huma murija bl-aħmar.Il-pożizzjonijiet tal-ħames NT α-helizes huma indikati bħala (H1-H5)28.
F'pH <6.5, l-HT jiddimerizza, billi huwa reżistenti għad-denaturazzjoni kkaġunata mis-sħana jew mill-urea18.Biex jiġi spjegat kif id-dimerizzazzjoni u l-istabbiltà tal-NT jaffettwaw il-ġelazzjoni, soluzzjonijiet li fihom 100 mg/ml NT ġew ikkontrollati f'pH 8, 7, u 6 bl-użu tat-test tal-inverżjoni tal-kunjett.Kampjuni NT inkubati f'pH 8 u 7 ġelled wara 30 min f'37 °C, iżda l-ġell ta 'pH 8 baqa' ċar, filwaqt li l-ġell ta 'pH 7 wera preċipitat viżibbli (Fig. 5a).B'kuntrast, soluzzjoni li fiha HT f'pH 6 ma ffurmatx ġel, u preċipitat kbir jista 'jidher wara 20 min f'37 ° C.Dan jissuġġerixxi li d-dimeri nfushom u/jew l-istabbiltà ogħla tagħhom meta mqabbla mal-monomeri jipprevjenu l-ġelazzjoni.Il-formazzjoni ta 'preċipitat għal NT f'pH 7 u 6 ma kinitx mistennija, peress li ġie rrappurtat li NT jinħall f'200 mg/ml27, faċilment jerġa' jintewa wara denaturazzjoni tas-sħana, u jżomm ukoll α-helix f'valuri aktar baxxi ta ' pH 18. Spjegazzjoni probabbli għal dawn id-diskrepanzi hija li l-esperimenti rrappurtati qabel twettqu f'temperatura ambjentali jew inqas, jew f'konċentrazzjonijiet ta 'proteini relattivament baxxi16,18,19.
Test tal-inverżjoni tal-kunjett NT (100 mg/mL) f'pH 8, 7, 6 u 154 mM NaCl (pH 8) wara inkubazzjoni f'37°C.b NT CD spettri bi u mingħajr 154 mM NaF u 154 mM NaCl, rispettivament.L-ellittiċità molari f'222 nm tiġi kkonvertita fi proporzjon ta' jingħalaq naturali.c Assaġġ ta 'inverżjoni NT (100 mg/mL) NT* (37 °C u 60 °C), NTA72R (37 °C), u His-NT-L6 (37 °C u 60 °C).d Spettri CD ta' mutanti NT NT*, NTA72R, u His-NT-L6.L-ellittiċità molari f'222 nm tiġi kkonvertita fi proporzjon ta' jingħalaq naturali.e Test ta' inverżjoni ta' NTFlSp, NTMiSp u NTMiSp imnaqqas (100 mg/mL).Skala bar 5 mm.f ispettri CD ta' NT, NTFlSp, NTMiSp u NTMiSp imnaqqsa.L-ellittiċità molari f'222 nm tiġi kkonvertita fi proporzjon ta' jingħalaq naturali.L-ispettri NT sħaħ f'25 °C u 95 °C huma murija fil-Figura Supplimentari 8.
Il-konċentrazzjoni fiżjoloġika tal-melħ tiddetermina interazzjonijiet elettrostatiċi bejn subunitajiet NT u dimerizzazzjoni tat-trasferiment NT għal pH18 aktar baxx.Sibna li l-preżenza ta '154 mM NaCl u NaF tabilħaqq inibixxu l-ġelazzjoni, rispettivament (Fig. 5a, b; Fig. Supplimentari 2b) u li dawn l-imluħa żiedu l-istabbiltà termali tal-monomeri NT (Fig. 5b, Fig. 8 Supplimentari) .Jissuġġerixxi wkoll li t-titjib tal-istabbiltà, aktar milli d-dimerizzazzjoni, jipprevjeni l-formazzjoni tal-ġel.
Biex tesplora aktar ir-rwol tad-dimerizzazzjoni tal-proteini u l-istabbiltà fil-ġelazzjoni, użajna żewġ mutanti, NT * u NTA72R, li jibqgħu wkoll monomeriċi f'pH28.30 baxx.NT * huwa mutant ta 'treġġigħ lura ta' ħlas doppju li fih id-distribuzzjoni apparenti ta 'ċarġ dipolari tal-monomeru hija ċċattjata, li tipprevjeni d-dimerizzazzjoni u żżid drastikament l-istabbiltà tal-monomeru.NTA72R huwa dipol iċċarġjat, iżda Ala sostitwita b'Arg tinsab fil-konfini tad-dimer, għalhekk il-mutazzjonijiet jinterferixxu mal-interazzjonijiet tas-subunità meħtieġa għad-dimerizzazzjoni.Mal-inkubazzjoni f'37 ° C, NT * ma fformax idroġel, filwaqt li NTA72R ifforma ġel opak għal 15-il minuta (Fig. 5c).Peress li kemm NT * u NTA72R ma jistgħux jiddimerizzaw iżda jvarjaw fl-istabbiltà tal-monomeru (Fig. 5d), dawn ir-riżultati jissuġġerixxu bil-qawwa li stabbiltà termodinamika għolja tipprevjeni NT mill-ġelu.Dan huwa appoġġjat ukoll mill-fatt li HT * jifforma ġel meta jkun instabbli f'temperatura għolja (wara 8 min f'60 ° C; Fig. 5c).Preċedentement intwera li l-kontenut għoli ta 'methionine f'NT likwifikat it-tiwi naturali tiegħu u li sitt sostituti ta' Met għal Leu (imsejħa hawn bħala His-NT-L6) jistabbilizzaw bil-qawwa l-monomeru NT46.Ibbażat fuq is-suppożizzjoni li l-flessibbiltà strutturali hija meħtieġa għall-formazzjoni tal-ġel NT, sibna li l-mutant stabbli His-NT-L6 ma ġellx f'37 °C (Figura 5c, d).Madankollu, His-NT-L6 ifforma wkoll ġel mal-inkubazzjoni f'60 ° С għal 60 min (Fig. 5c).
L-abbiltà ta 'NT li tittrasforma fi strutturi β-sheet u tifforma hydrogels tidher li tapplika għal xi wħud iżda mhux kollha tad-dominji NT ta' spidroin.NTs minn tipi differenti ta 'ħarir u speċi brimba, Trichonephila clavipes (NTFlSp), iffurmaw ġellijiet minkejja l-kontenut relattivament baxx tagħhom ta' methionine u stabbiltà termali għolja (Fig. 5e, f u Tabella Supplimentari 2).B'kuntrast, NT mill-proteina ampullar żgħira spidroin minn Araneus ventricosus (NTMiSp) bi stabbiltà termali baxxa u kontenut għoli ta 'methionine ma ffurmawx idroġels (Tabella Supplimentari 2 u Fig. 5e, f).Dan tal-aħħar jista 'jkun assoċjat mal-preżenza ta' bonds disulfide intramolekulari29,47.B'mod konsistenti, meta r-rabtiet disulfide ta 'NTMiSp tnaqqsu, ifforma idroġel wara inkubazzjoni f'37 ° C għal 10 min (Fig. 5e).Bħala konklużjoni, għandu jiġi nnutat li l-flessibbiltà strutturali hija kriterju importanti, iżda mhux l-uniku, għall-formazzjoni ta 'ġel minn NT.Fattur ieħor li jista 'jkun rilevanti huwa l-propensità li jiffurmaw fibri amyloid, u l-analiżi mad-database taż-żippijiet u l-algoritmu Waltz wrew korrelazzjoni bejn il-kapaċità li jiffurmaw ġellijiet u l-preżenza ta' reġjuni amilojdoġeniċi, kif ukoll il-firxa tar-reġjuni mbassra. biex jiffurmaw żippijiet steriċi.Kien hemm korrelazzjoni (Tabella Supplimentari 2 u Fig. 9 Supplimentari).
Il-kapaċità ta 'NT li jifforma fibrils u jifforma ġellijiet taħt kundizzjonijiet favorevoli wasslitna biex ipoteżi li l-fużjonijiet NT ma' frammenti oħra ta 'proteini xorta jistgħu jiffurmaw ġellijiet b'funzjoni sħiħa ta' msieħba tal-fużjoni.Biex nittestjaw dan, introduċejna proteina fluworexxenti ħadra (GFP) u purine nucleoside phosphorylase (PNP) fil-C-terminal tal-NT, rispettivament.Il-proteini tal-fużjoni li rriżultaw ġew espressi f'E. coli b'rendiment finali għoli ħafna (150 mg/L u 256 mg/L kulturi ta' shake flask għal His-NT-GFP u His-NT-PNP, rispettivament), konsistenti ma' dak li ġie muri għal Proteini oħra mdewba ma' NT Ref.30. Il-proteini tal-fużjoni His-NT-GFP (300mg/mL) u His-NT-PNP (100mg/mL) iffurmaw ġellijiet wara 2 sigħat u 6.5 sigħat f'37 ° C u, importanti, il-frazzjoni tal-GFP baqgħet ma nbidlitx.osservati wara l-ġelazzjoni, b'> 70% tal-intensità tal-fluworexxenza inizjali li tibqa 'wara l-ġelazzjoni (Fig. 6a).Biex tkejjel l-attività tal-PNP fis-soluzzjonijiet u l-ġellijiet tiegħu-NT-PNP, kellna nħalltu l-proteina tal-fużjoni b'NT minħabba li l-attività enżimatika tal-preparazzjoni pura kienet barra mill-firxa ta 'skoperta tal-assaġġ f'konċentrazzjonijiet ta' ġelling.Il-ġel ffurmat b'taħlita li fiha 0.01 mg/mL His-NT-PNP u 100 mg/mL NT żamm 65% tal-attività enżimatika inizjali tal-kampjuni preinkubati (Fig. 6b).Il-ġell baqa' intatt matul il-kejl (Fig. 10 Supplimentari).
a Intensità relattiva tal-fluworexxenza qabel u wara l-ġelazzjoni ta' His-NT-GFP (300 mg/mL) u kunjett maqlub li fih l-idroġel His-NT-GFP (300 mg/mL) taħt dawl viżibbli u UV.Il-punti juru kejl individwali (n = 3), il-vireg ta 'żball juru devjazzjoni standard.Il-valur medju jidher fiċ-ċentru tal-vireg tal-iżball.b L-attività PNP inkisbet b'analiżi fluworometrika bl-użu ta' soluzzjonijiet u ġellijiet li jikkonsistu f'NT (100 mg/ml) u taħlita li fiha 0.01 mg/ml his-NT-PNP u 100 mg/ml Dollari Tajwani ġodda.Id-daħla turi kunjett maqlub li fih idroġel li fih His-NT-PNP (bar tal-iskala ta' 5 mm).
Hawnhekk, nirrapportaw il-formazzjoni ta 'idroġels minn NT u proteini spidroin rikombinanti oħra billi inkubaw soluzzjoni ta' proteina f'37 ° C (Figura 1).Aħna nuru li l-ġelazzjoni hija assoċjata mat-trasformazzjoni ta 'α-helizes f'saffi β u l-formazzjoni ta' fibri li jixbħu l-amilojdi (Figuri 3 u 4).Din is-sejba hija sorprendenti peress li l-NTs huma qatet globulari ta' ħames helix ikkoljati magħrufa għas-solubilità estremament għolja u l-istabbiltà għolja tagħhom f'konċentrazzjonijiet> 200 mg/mL f'4°C għal diversi jiem27.Barra minn hekk, NTs jerġgħu jintwew malajr wara denaturazzjoni tas-sħana f'konċentrazzjonijiet baxxi ta 'proteini f'µM.Skont ir-riżultati tagħna, il-formazzjoni tal-fibril teħtieġ taħlita ta 'konċentrazzjoni ta' proteina> 10 mg/mL u temperatura kemmxejn elevata (Fig. 1).Dan huwa konsistenti mal-idea li fibri tal-amilojdi jistgħu jiffurmaw minn proteini mitwija b'mod globulari li huma fi stat parzjalment mhux mitwija minħabba varjazzjonijiet termali taħt kundizzjonijiet fiżjoloġiċi 48 .Eżempji ta 'proteini li jgħaddu minn din il-konverżjoni jinkludu insulina49,50, β2-microglobulin, transthyretin u lysozyme51,52,53.Għalkemm NT huwa α-helix fl-istat nattiv tiegħu, madwar 65% ​​tal-katina tal-polypeptide hija kompatibbli mal-formazzjoni ta 'żippijiet steriċi (Fig. 4e) 45 .Peress li l-monomeru huwa dinamikament mobbli46, jista 'esponi dawn ir-reġjuni amilojdoġeniċi potenzjali f'temperaturi moderatament elevati u f'konċentrazzjonijiet għoljin ta' proteina totali jista 'jilħaq konċentrazzjoni kritika għall-formazzjoni tal-fibril amilojde54.Wara dan ir-raġunament, sibna korrelazzjoni negattiva bejn il-konċentrazzjoni ta 'spidroin u l-ħin tal-ġelazzjoni (Fig. 1c), u jekk il-konformazzjoni NT monomerika tiġi stabbilizzata jew b'mutazzjonijiet (NT*, His-NT-L6) jew biż-żieda tal-melħ, tista' tipprevjeni l- formazzjoni idroġels (Fig. 5).
Fil-biċċa l-kbira tal-każijiet, il-fibri tal-amilojdi jisparixxu mis-soluzzjoni bħala preċipitat, iżda taħt ċerti kundizzjonijiet jistgħu jiffurmaw hydrogels55,56,57.Il-fibri li jiffurmaw l-idroġel tipikament għandhom proporzjon ta 'aspett għoli u jiffurmaw netwerks tridimensjonali stabbli permezz ta' taħbil molekulari,55,58 konsistenti mar-riżultati tagħna.Għall-formazzjoni ta 'idroġel in vitro, il-proteini spiss jinfetħu kompletament jew parzjalment, pereżempju, b'espożizzjoni għal solventi organiċi, temperatura għolja (70-90 ° C) u/jew pH baxx (1.5-3.0)59,60,61,62.L-idrogels spidroin deskritti hawn ma jeħtiġux ipproċessar ħarxa, u lanqas ma jeħtieġu aġenti ta 'cross-linking biex jistabbilizzaw l-idroġels.
Preċedentement ġie rrappurtat li spidroin tirrepeti u QDs, li jidhru li jgħaddu minn bidla tal-folja β waqt l-għażil tal-ħarir, jiffurmaw hydrogels.Meta mqabbla mas-sejbiet tagħna, il-ħinijiet ta 'inkubazzjoni u/jew it-temperaturi ta' inkubazzjoni kienu sinifikament itwal jew ogħla, rispettivament, u l-idroġels li rriżultaw ħafna drabi kienu opaki (Figura 7 u Tabella Supplimentari 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Minbarra l-ħinijiet tal-ġel veloċi, NT hydrogels >300 mg/mL (30%) qabżu l-idroġels tal-proteini tal-ħarir tal-brimba rikombinanti deskritti l-oħra kollha, kif ukoll idroġels naturali bħal ġelatina, alġinat (2%), agar (0.5 %). ) u kollaġen.(0.6%) (Figura 7 u Tabelli Supplimentari 1 u 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Il-ħin tal-ġel u l-modulu elastiku tal-idroġels f'dan l-istudju tqabblu ma 'hydrogels oħra bbażati fuq spidroin u hydrogels naturali magħżula.Jingħataw referenzi flimkien ma' deskrizzjoni tal-kundizzjonijiet tal-ġelazzjoni.APS Ammonju persulfate, temperatura tal-kamra.Dejta 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Jidher li l-brimb żviluppaw modi biex jipprevjenu l-ispidroin milli jiġġedded waqt il-ħażna.Minkejja l-konċentrazzjoni għolja ta 'proteina fil-glandola tal-ħarir, ir-reġjun ripetut kbir assoċjat mad-dominju terminali jfisser li l-konċentrazzjoni apparenti ta' NT u CT fil-glandola tikkorrispondi għal madwar 10-20 mg / ml, fil-konfini ta 'dan l-istudju.meħtieġa għall-formazzjoni ta' idroġel osservat in vitro.Barra minn hekk, konċentrazzjonijiet simili ta 'melħ 16 stabbilizzaw NT, bħal fil-glandoli tal-ħarir (Fig. 5b).Il-konformazzjoni NT ġiet studjata fiċ-ċitosol ta 'E. coli u nstabet li hija mitwija aktar sewwa milli meta eżaminata in vitro, u tindika aktar li l-melħ jew fatturi oħra jipprevjenu l-aggregazzjoni tiegħu in vivo.Madankollu, il-kapaċità ta 'NTs li jittrasformaw fi fibrils β-sheet tista' tkun importanti għall-formazzjoni tal-filament u għandha tiġi investigata fi studji futuri.
Minbarra l-aspetti ġodda tal-formazzjoni ta 'fibril u hydrogel simili NT-amyloid osservati f'dan l-istudju, nuru wkoll li dan il-fenomenu jista' jkollu applikazzjonijiet bijoteknoloġiċi u bijomediċi (Fig. 8).Bħala prova tal-kunċett, għaqqadna NT ma 'GFP jew PNP u wrejna li l-proteina tal-fużjoni tifforma wkoll idroġels meta tkun inkubata f'37 °C u li l-frazzjonijiet GFP u PNP fil-biċċa l-kbira jżommu l-attività tagħhom wara l-ġelazzjoni (Figura 6).Nucleoside phosphorylases huma katalisti importanti sintesi ta 'analogi nukleosidi75, li jagħmel l-iskoperta tagħna rilevanti għall-industrija bijofarmaċewtika.Il-kunċett ta 'espressjoni ta' proteini tal-fużjoni li jiffurmaw idroġels trasparenti taħt kundizzjonijiet favorevoli jippermetti l-ħolqien ta 'idroġels funzjonalizzati bi proprjetajiet favorevoli għal firxa wiesgħa ta' applikazzjonijiet bħal immobilizzazzjoni tal-enżimi, rilaxx ikkontrollat ​​tad-droga u inġinerija tat-tessuti.Barra minn hekk, NT u NT * huma markaturi ta 'espressjoni effiċjenti30, li jfisser li NT u l-varjanti tiegħu jistgħu jintużaw għall-produzzjoni b'rendiment għoli ta' proteini tal-fużjoni solubbli u l-ħolqien sussegwenti ta 'proteini mmirati immobilizzati f'idroġels 3D.
NT huwa solubbli, α-helical u stabbli f'konċentrazzjonijiet baxxi (µM) u 37°C.Fl-istess temperatura, iżda f'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu (> 10 mg/ml), NT jifforma ġellijiet li jikkonsistu minn fibri li jixbħu l-amilojde.Proteini tal-fużjoni NT jiffurmaw ukoll ġellijiet fibrillari bi frammenti ta 'fużjoni kompletament funzjonali, li jippermettu li diversi proteini jiġu immobilizzati f'idroġels 3D bl-użu ta' NT.Qiegħ: NT (PDB: 4FBS) u illustrazzjonijiet ta 'netwerks tal-fibra u strutturi ta' proteini assoċjati (assunti u mhux miġbuda fuq skala, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Il-kostruzzjonijiet (ara Tabella Supplimentari 4 għal lista kompluta li tinkludi sekwenzi ta 'aċidi amminiċi) ġew ikklonati fi plasmid pT7 u trasformati f'E. coli BL21 (DE3).E. coli li fihom plasmidi maħduma ġew imlaqqma f'brodu Luria supplimentat b'kanamycin (70 mg/l) u mkabbra matul il-lejl f'30 ° C u 250 rpm.Il-kultura mbagħad ġiet imlaqqma 1/100 f'medja LB li fiha kanamycin u kkultivata fi 30 ° C u 110 rpm sakemm l-OD600 laħaq 0.8.Għal studji NMR, batterji tkabbru f'medju minimu M9 li kien fih 2 g ta 'D-glucose 13C (Aldrich) u 1 g ta' ammonju chloride 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) għal tikkettjar ta 'proteini b'isotopi.Naqqas it-temperatura għal 20 grad Celsius u induċi espressjoni tal-proteina b'0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (konċentrazzjoni finali).Wara l-espressjoni tal-proteina matul il-lejl, iċ-ċelloli nħasdu f'7278 × g, 4 ° C għal 20 min.Il-gerbub taċ-ċelluli ġew sospiżi mill-ġdid f'20 mM Tris-HCl, pH 8, u ffriżati sa aktar użu.Iċ-ċelluli mdewba ġew lysed bl-użu ta 'disruptor taċ-ċelluli (magni tas-serje TS, Constant Systems Limited, l-Ingilterra) f'30 kPa.Imbagħad il-lysates ġew ċentrifugati f'25,000 g għal 30 minuta f'4 ° C.Għal NTMiSp, il-pellet kien imbagħad sospiż mill-ġdid f'2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, u ivvibrat għal 2 min (2 s mixgħul/mitfi, 65%), imbagħad ċentrifugat mill-ġdid f'25,000 xg, 4 ° C. 30 min.Is-supernatant ġie mgħobbi fuq kolonna Ni-NTA, maħsul b'20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, u finalment il-proteina ġiet eluduta b'20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Biex tiġġenera NT2RepCT u NTCT, id-diġestjoni tat-trombina tintroduċi s-sit (ThrCleav) bejn His u NT.Is-siti tal-qsim tat-trombina huma preżenti wkoll f'His-NT-ThrCleav-2Rep (jipproduċi 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (jipproduċi NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (jipproduċi CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (jipproduċi NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (jipproduċi NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (jipproduċi NTF1Sp), u His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (jipproduċi NTMiSp).Il-kostruzzjonijiet ġew diġeriti bit-trombina (1:1000) u djalizzati matul il-lejl f'4 ° C. b'20 mM Tris-HCl, pH 8, bl-użu ta 'membrana tad-dijalisi Spectra/Por b'limitu ta' piż molekulari ta '6-8 kDa.Wara d-dijalisi, is-soluzzjoni titgħabba fuq kolonna Ni-NTA u l-effluwent li fih il-proteina ta' interess jinġabar.Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini ġew determinati billi titkejjel l-assorbiment tal-UV f'280 nm bl-użu tal-koeffiċjent ta 'estinzjoni ta' kull proteina, ħlief għal NTF1Sp, li uża l-assaġġ Bradford skont il-protokoll tal-manifattur.Il-purità ġiet iddeterminata permezz ta 'elettroforeżi tal-ġel SDS polyacrylamide (4-20%) u tbajja' blu brillanti Coomassie.Il-proteini ġew ikkonċentrati bl-użu ta 'filtri ċentrifugi (VivaSpin 20, GE Healthcare) f'4000 xg b'qtugħ ta' piż molekulari ta '10 kDa f'ċikli ta' 20 minuta.
Ħoll is-soluzzjoni tal-proteina u daħħal b'attenzjoni 150 µl f'kunjett ta' septum ċar ta' 1 ml (8 x 40 mm Thermo Scientific).It-tubi ġew mgħottija u ssiġillati b'parafilm biex jipprevjenu l-evaporazzjoni.Kampjuni (n = 3) ġew inkubati f'37 ° C jew 60 ° C u perjodikament maqlubin biex josservaw il-ġelazzjoni.Kampjuni li ma ġellilhomx ġew inkubati għal mill-inqas ġimgħa.Naqqas il-bonds disulfide NTMiSp b'10 mM DTT għal kull proteina 10 µM.Biex tanalizza l-ġelazzjoni ta 'kisi naturali tal-ħarir tal-brimba, il-brimba tal-pont Svediża ġiet maqtugħa, iż-żewġ glandoli ampullati ewlenin tqiegħdu f'200 μl ta' 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 u maqtugħin biex jippermettu li l-kisja tissepara mill-glandoli..Il-kontenut tal-glandoli jinħall f'buffer, 50 µl għad-determinazzjoni tal-piż xott (b'inkubazzjoni ta' kunjetti miftuħa f'60 °C għal piż kostanti) u 150 µl għall-ġelazzjoni f'37 °C.
Il-ġeometrija/għodda tal-kejl hija magħmula minn azzar li ma jissaddadx bl-użu ta 'pjanċa parallela b'dijametru ta' fuq ta '20 mm u spazju ta' 0.5 mm.Saħħan il-kampjun minn 25 °C sa 45 °C u lura għal 25 °C b'rata ta' 1 °C kull minuta billi tuża pjanċa Peltier tal-qiegħ tal-istainless steel.Il-kejl tal-vibrazzjoni twettaq bi frekwenza ta '0.1 Hz u fir-reġjun viscoelastiku lineari tal-materjal f'razza ta' 5% u 0.5% għal kampjuni ta '100 mg/mL u 300-500 mg/mL, rispettivament.Uża kamra tal-umdità apposta biex tevita l-evaporazzjoni.Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta’ Prism 9.
Għall-ġbir ta' spettri infra-aħmar (IR) f'temperatura tal-kamra minn 800 sa 3900 cm–1.L-apparat ATR, kif ukoll il-mogħdija tad-dawl mill-ispettrometru, jitnaddaf b'arja ffiltrata niexfa qabel u waqt l-esperiment.Soluzzjonijiet (500 mg/mL biex jimminimizzaw il-qċaċet ta 'assorbiment ta' l-ilma fl-ispettri) ġew pipettati fuq il-kristalli, u ġellijiet (500 mg/mL) ġew iffurmati qabel il-kejl u mbagħad trasferiti għall-kristalli (n = 3).Ġew irreġistrati 1000 skans b'riżoluzzjoni ta '2 cm-1 u ċiklu ta' xogħol żero ta '2. It-tieni derivattiva ġiet ikkalkulata bl-użu ta' OPUS (Bruker) bl-użu ta 'firxa ta' twittija ta 'disa' punti.L-ispettri ġew normalizzati għall-istess reġjun ta 'integrazzjoni bejn 1720 u 1580 cm-1 bl-użu ta' F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software".Fl-ispettroskopija ATR-IR, il-fond tal-penetrazzjoni ta 'raġġ infra-aħmar f'kampjun huwa dipendenti fuq in-numru ta' mewġ, li jirriżulta f'assorbiment aktar qawwi f'numri ta 'mewġ aktar baxxi milli f'numri ta' mewġ ogħla.Dawn l-effetti ma ġewx ikkoreġuti għall-ispettri murija fil-Fig.3 minħabba li huma żgħar ħafna (Fig. 4 Supplimentari).L-ispettri kkoreġuti għal din iċ-ċifra ġew ikkalkulati bl-użu tas-softwer Bruker OPUS.
Fil-prinċipju, kwantifikazzjoni komprensiva tal-konformazzjonijiet tal-proteini hija possibbli wara dekonvoluzzjoni affidabbli tal-komponenti fil-quċċata tal-amide I.Madankollu, fil-prattika jinqalgħu xi ostakli.L-istorbju fl-ispettru jista' jidher bħala qċaċet (foloz) waqt id-dekonvoluzzjoni.Barra minn hekk, il-quċċata minħabba t-tgħawwiġ tal-ilma tikkoinċidi mal-pożizzjoni tal-quċċata tal-amide I u jista 'jkollha kobor simili għal kampjuni li fihom ammont kbir ta' ilma, bħall-ġell akweju studjat hawn.Għalhekk, aħna ma ppruvajniex niddekomponu kompletament il-quċċata tal-amide I, u l-osservazzjonijiet tagħna għandhom jitqiesu biss bħala appoġġ għal metodi oħra bħall-ispettroskopija NMR.
Soluzzjonijiet ta '50 mg/ml NT u His-NT2RepCT ġew ġelati matul il-lejl f'37 ° C.L-idroġel imbagħad ġie dilwit b'20 mM Tris-HCl (pH 8) għal konċentrazzjoni ta' 12.5 mg/ml, ħawwad sew u ppapettat biex jitkisser il-ġell.Sussegwentement, l-idroġel ġie dilwit 10 darbiet b'20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl tal-kampjun ġew applikati għal grilja tar-ram miksija b'formvar, u l-kampjun żejjed tneħħa b'karta blotting.Il-kampjuni ġew maħsula darbtejn b'5 µl ta' ilma MilliQ u mtebbgħin b'1% uranyl format għal 5 minuti.Neħħi t-tebgħa żejda b'karta assorbenti, imbagħad nixxef il-malja bl-arja.L-immaġini saru fuq dawn il-grids bl-użu ta’ FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN li jaħdem f’100 kV.L-immaġini ġew irreġistrati f'ingrandimenti x 26,500 u x 43,000 bl-użu ta 'kamera Veleta 2k × 2k CCD (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, il-Ġermanja).Għal kull kampjun (n = 1), ġew irreġistrati 10-15 immaġini.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) intuża għall-analiżi tal-immaġni u l-kejl tad-dijametri tal-fibri (n = 100, fibri differenti).Prism 9 intużat biex iwettaq t-testijiet mhux imqabbla (żewġ denbu).Il-fibri medji His-NT2RepCT u NT kienu 11.43 (SD 2.035) u 7.67 (SD 1.389) nm, rispettivament.L-intervall ta 'kunfidenza (95%) huwa -4.246 sa -3.275.gradi ta 'libertà = 198, p < 0.0001.
80 µl ta 'kampjuni likwidi li fihom 10 µM thioflavin T (ThT) ġew imkejla fi tliet kopji (n = 3) taħt kundizzjonijiet statiċi bl-użu ta' pjanċi tal-qiegħ ċari tal-qiegħ iswed Corning 96-well (Corning Glass 3881, USA).Id-differenzi fil-fluworexxenza ġew irreġistrati bl-użu ta 'filtru ta' eċċitazzjoni ta '440 nm u filtru ta' emissjoni 480 nm (FLUOStar Galaxy minn BMG Labtech, Offenburg, il-Ġermanja).Is-sinjal ThT la kien saturat u lanqas mitfi, peress li saru esperimenti b'konċentrazzjonijiet differenti ta 'ThT mingħajr ma nbidlet l-intensità tas-sinjal.Irreġistra l-assorbiment fi 360 nm għall-kejl taċ-ċpar.Għal esperimenti ta 'żrigħ, ġels ta' 100 mg/mL ġew iffurmati f'37 ° C, sospiżi mill-ġdid, u użati għaż-żrigħ fi proporzjonijiet molari ta '5%, 10%, u 20%.Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta’ Prism 9.
Ħoll il-ħażniet ta' His-NT2RepCT u NT >100 mg/mL fuq is-silġ u ffiltra minn filtru ta' 0.22 µm.Il-konċentrazzjonijiet ġew ikkalkulati billi titkejjel l-assorbiment f'280 nm bl-użu ta 'Nanodrop.F'bjar ta' pjanċa sewda li ma torbotx b'96 bir (Corning) b'qiegħ ċar, il-kampjuni ġew dilwiti għal 20 mg/ml f'20 mM Tris-HCl pH 8 u mħallta ma' 5 μM ThT (konċentrazzjoni finali), konċentrazzjoni totali tal-kampjun 50 μl volum.Il-kampjuni ġew immaġnijiet kull 10 minuti f'37 °C fuq mikroskopju CellObserver (Zeiss) b'kanal tad-dawl trażmess u settijiet ta 'filtri ta' eċċitazzjoni u emissjoni FITC għal immaġini ThT.Lenti 20x/0.4 tintuża għall-immaġini.Zen Blue (Zeiss) u ImageJ (https://imagej.nih.gov/) intużaw għall-analiżi tal-immaġni.Ġellijiet ġew ippreparati wkoll minn soluzzjonijiet NT u His-NT2RepCT f'konċentrazzjoni ta '50 mg/mL li fihom 20 mM Tris pH 8 u 5 µM ThT u inkubati f'37 ° C għal 90 min.Il-biċċiet tal-ġel ġew trasferiti għal bir ġdid li fih 20 mM Tris, pH 8, u 5 μM ThT fi pjanċa tal-qiegħ ċara sewda sewda li ma torbotx.Akkwista fluworexxenza ħadra u immaġini ta 'kamp qawwi b'ingrandiment ta' 20x/0.4.ImageJ intuża għall-analiżi tal-immaġni.
L-ispettri tas-soluzzjoni NMR inkisbu f'310 K fuq spettrometru Bruker Avance Neo ta' 600 MHz mgħammar bi QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Kampjuni NMR li fihom 10 mg/mL proteina omoġenja ttikkettjata b'13C, 15N, maħlula f'20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Ċaqliq kimiċi ta 'NT2RepCT f'pH 6.7 intużaw biex jassenjaw il-quċċata 23 fl-ispettru 2D ta' 15N-HSQC.
Angolu maġiku li jdawru l-ispettri solidi NMR (MAS) ta '13C, idroġelli ttikkettjati 15N ġew irreġistrati fuq spettrometru Bruker Avance III HD f'800 MHz mgħammar b'sonda mingħajr elettrons ta' 3.2 mm 13C/15N{1H}.It-temperatura tal-kampjun ġiet ikkontrollata bl-użu ta 'fluss tal-gass b'temperatura varjabbli f'277 K. Spettri ta' reżonanza rotazzjonali ta 'dipole bidimensjonali (DARR) 76 u konnessjoni mill-ġdid tal-frekwenza tar-radju (RFDR) 77 ġew akkwistati fi frekwenzi MAS ta' 12.5 kHz u 20 kHz, rispettivament.Cross polarization (CP) minn 1H sa 13C saret bl-użu ta 'rampa lineari minn 60.0 sa 48.0 kHz f'1H, 61.3/71.6 kHz f'13C (f'12.5/20 kHz MAS) u ħin ta' kuntatt 0.5-1 ms.Intuża d-diżakkoppjament Spinal6478 f'73.5 kHz waqt il-ġbir tad-dejta.Il-ħin tal-akkwist kien 10 millisekondi u d-dewmien taċ-ċiklu kien ta '2.5 sekondi.Il-korrelazzjonijiet Cα/Cβ b'rabta waħda osservati fl-ispettri RFDR ġew assenjati fuq il-bażi tal-bidliet kimiċi tat-tip ta 'residwu karatteristiċi u l-korrelazzjonijiet multiply-linked fl-ispettri DARR.
Id-database Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) intużat biex tevalwa t-tendenzi tal-flutter u l-enerġija Rosetta għal NT, NTFlSp, u NTMiSp.Id-database Zipper tikkalkula Rosetta Energy80, li tgħaqqad bosta funzjonijiet ta 'enerġija ħielsa biex timmudella u tanalizza l-istruttura tal-proteini.Livell ta' enerġija ta' -23 kcal/mol jew inqas jindika tendenza għolja ta' fibrillazzjoni.L-enerġija aktar baxxa tfisser aktar stabbiltà taż-żewġ linji β fil-konformazzjoni taż-żippijiet.Barra minn hekk, l-algoritmu Waltz intuża biex ibassar reġjuni amilojdoġeniċi f'NT, NTFlSp u NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Is-soluzzjoni tal-proteina NT tħallat ma '2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer f'pH 5.5 u 6.0 biex tnaqqas il-pH għal pH 6 u 7, rispettivament.Il-konċentrazzjoni finali tal-proteina kienet 100 mg/ml.
Il-kejl sar fuq spettrometru CD J-1500 (JASCO, USA) bl-użu ta 'cuvette ta' 300 μL b'passaġġ ottiku ta '0.1 ċm.Il-proteini ġew dilwiti għal 10 μM (n = 1) f'20 mM buffer tal-fosfat (pH 8).Biex tanalizza l-istabbiltà tal-proteini fil-preżenza tal-melħ, il-proteini ġew analizzati fl-istess konċentrazzjoni (n = 1) f'20 mM buffer tal-fosfat (pH 8) li fih 154 mM NaF jew NaCl, rispettivament.Skans tat-temperatura ġew irreġistrati f'222 nm minn 25 ° C sa 95 ° C b'rata ta 'tisħin ta' 1 ° C / min.Il-proporzjon ta 'proteini mitwija b'mod nattiv ġie kkalkulat bl-użu tal-formula (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Barra minn hekk, ġew irreġistrati ħames spettri għal kull kampjun minn 260 nm sa 190 nm f'25 ° C u wara tisħin għal 95 ° C.Ħames spettri ġew medjati, lixxa u kkonvertiti għal ellittiċità molari.Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta’ Prism 9.
L-intensità tal-fluworexxenza ta 'His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ġiet imkejla fi tliet kopji (n = 3) fi pjanċi Corning ta' 96 bir b'qiegħ trasparenti iswed (Corning Glass 3881, USA) taħt kundizzjonijiet statiċi.Kejjel kampjuni b'qarrej tal-pjanċa bbażat fuq il-fluworexxenza b'tul ta' mewġ ta' eċċitazzjoni ta' 395 nm u rrekordja l-emissjoni f'509 nm qabel il-ġelazzjoni u sagħtejn wara f'37°C.Id-dejta ġiet analizzata bi Prism 9.
Kit ta 'assaġġ ta' attività ta 'purine nucleoside phosphorylase (metodu fluworometriku, Sigma Aldrich) intuża skond l-istruzzjonijiet tal-manifattur.Biex tkejjel l-attività f'ġels u soluzzjonijiet li fihom His-NT-PNP, ħallat 10 ng ta' His-NT-PNP ma' 100 mg/mL NT għal volum totali ta' 2 µL minħabba li l-ġell ta sinjal 'il fuq mill-intervall ta' skoperta tas-sett.Ġew inklużi kontrolli għal ġellijiet u soluzzjonijiet mingħajr His-NT-PNP.Il-kejl sar darbtejn (n = 2).Wara li l-attività kienet imkejla, it-taħlita ta 'reazzjoni tneħħiet u l-ġell ġie fotografat biex jiġi żgurat li l-ġell baqa' intatt matul il-kejl.Id-dejta ġiet analizzata bl-użu ta’ Prism 9.
Għal aktar informazzjoni dwar id-disinn tal-istudju, ara l-astratt tal-istudju dwar in-Natura marbut ma’ dan l-artikolu.
Il-Figuri 1 u 2 jippreżentaw id-dejta inizjali.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, u 6, Figuri Supplimentari.3, fig supplimentari.5a, d, fig supplimentari.6 u fig supplimentari.8. Dejta Dejta minn dan l-istudju hija ospitata fid-database Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Id-dejta tal-NMR miksuba f'dan l-istudju ġiet imqiegħda fir-repożitorju tal-BMRBig taħt l-ID tad-dħul bmrbig36.L-istrutturi ta 'GFP u PNP ttieħdu minn PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. u Johansson, J. Spinning ħarir brimba artifiċjali.Kimika Nazzjonali.bijoloġija.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Il-ġenoma ta 'Nephila clavipes jenfasizza d-diversità tal-ġeni tal-ħarir tal-brimba u l-espressjoni kumplessa tagħhom.Genette Nazzjonali.49, 895–903 (2017).