347 12.7 * 1.24mm Stainless steel coiled tubing, Mekkaniżmu molekulari ta 'kondensazzjoni elettrostatika sinkronika u koaggregazzjoni ta' α-synuclein u tau

Grazzi talli żort Nature.com.Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Sliders li juru tliet artikoli għal kull slide.Uża l-buttuni ta 'wara u li jmiss biex timxi permezz tal-pjastri, jew il-buttuni tal-kontrollur tas-slajds fl-aħħar biex tiċċaqlaq minn kull slide.

347 Speċifikazzjoni tal-pajp ta 'l-Azzar li ma jsaddadx

347 12.7 * 1.24mm Stainless steel coiled tubing

Dijametru ta' Barra: 6.00 mm OD sa 914.4 mm OD, Daqsijiet sa 24” NB disponibbli Ex-stock, Daqs OD Tubi tal-Azzar disponibbli Ex-stock

Firxa tal-ħxuna tal-pajp SS 347: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, eċċ. (0.5-12mm) Jew daqs mhux regolari li għandu jitfassal kif meħtieġ

Tip: SS 347 Pajpijiet mingħajr saldatura |Pajpijiet SS 347 ERW |SS 347 Pajpijiet Iwweldjati |SS 347 Pajpijiet Fabbrikati |Tubi SS 347 CDW, Pajpijiet LSAW / Iwweldjati bil-ħjata / Miġbudin mill-ġdid

Formola: SS 347 Pajpijiet/Tubi Tondi, SS 347 Pajpijiet/Tubi Kwadri, SS 347 Pajpijiet/Tubi Rettangolari, SS 347 Tubi Coiled, SS 347 Forma “U”, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Tubi Idrawliċi

Tul: Uniku Random, Doppju Random & Tul Meħtieġa Tmiem: Tarf Sempliċi, Tarf Beveled, Treaded

Protezzjoni Tmiem: Tappijiet tal-plastik |Finish ta 'barra: 2B, No.4, No.1, No.8 Mirror Finish għal Pajpijiet ta' l-Azzar li ma jsaddadx, Finish skond ir-Rekwiżiti tal-klijent

Kundizzjoni tal-Kunsinna: Ittemprat u Pickled, Illustrat, Ttemprat Bright, Miġbud fil-Kesaħ

Spezzjoni, Rapporti tat-Test: Ċertifikati tat-Test tal-Mitħna, EN 10204 3.1, Rapporti Kimiċi, Rapporti Mekkaniċi, Rapporti tat-Test PMI, Rapporti ta' Spezzjoni Viżwali, Rapporti ta' Spezzjoni ta' Parti Terza, Rapporti tal-Laboratorju Approvati NABL, Rapport tat-Test Distruttiv, Rapporti tat-Test Mhux Distruttivi

Ippakkjar: Ippakkjat f'Kaxxi tal-Injam, Basktijiet tal-plastik, Strixxi tal-Azzar Miġbura, jew skont it-Talbiet tal-Klijenti

Speċjali: Daqsijiet u Speċifikazzjonijiet minbarra hawn fuq jistgħu jiġu manifatturati fuq talba

SS 347 Medda tad-Daqs tal-Pipe: 1/2 pulzier NB, OD sa 24 pulzier

ASTM A312 347: Pajp awstenitiku wweldjat mingħajr saldatura u b'ħjata dritta maħsub għal temperatura għolja u servizz korrużiv ġenerali.Filler metall mhux permess waqt l-iwweldjar.

ASTM A358 347: Pajp awstenitiku wweldjat bil-fużjoni elettrika għal servizz korrużiv u/jew b'temperatura għolja.Tipikament pajp biss sa 8 pulzieri huwa prodott għal din l-ispeċifikazzjoni.Iż-żieda tal-metall tal-mili hija permessa waqt l-iwweldjar.

ASTM A790 347: Pajp ferritiku/awstenitiku (duplex) iwweldjat mingħajr saldatura u dritta maħsub għal servizz korrużiv ġenerali, b'enfasi partikolari fuq ir-reżistenza għall-qsim tal-korrużjoni tal-istress.

ASTM A409 347: Pajp tal-ħajt tad-dawl awstenitiku ta' dijametru kbir iwweldjat b'ħjata dritta jew b'ħjata spirali f'qisien minn 14" sa 30" b'ħitan Sch5S u Sch 10S għal korrużivi u/jew għoljin

ASTM A376 347: Pajp awstenitiku mingħajr saldatura għal applikazzjonijiet ta 'temperatura għolja.

ASTM A813 347: Pajp awstenitiku iwweldjat b'ħjata waħda, waħda jew doppja għal temperatura għolja u applikazzjonijiet korrużivi ġenerali.

ASTM A814 347: Pajp awstenitiku wweldjat bil-kesħa għal temperatura għolja u servizz korrużiv ġenerali.

347H Stainless Steel Pajpijiet Kompożizzjoni Kimika

Stainless Steel 347H Pipe Mechanical Properties

Stainless Steel 347H Pajpijiet Proprjetajiet Fiżiċi

Gradi Ekwivalenti għal Pajp ta 'l-Azzar Stainless 347H

Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregazzjoni hija karatteristika tal-marda ta 'Parkinson u sinukleinopatiji oħra.Riċentement, il-proteina tau komunement assoċjata mal-marda ta 'Alzheimer ġiet assoċjata mal-patoloġija αS u nstabet li tikkolocalizza f'inklużjonijiet b'ħafna αS, għalkemm il-mekkaniżmu molekulari tal-koaggregazzjoni taż-żewġ proteini għadu mhux ċar.Nirrapportaw hawnhekk li l-fażi αS tissepara f'kondensati likwidi permezz ta 'kondensazzjoni kumplessa elettrostatika b'polypeptides iċċarġjati b'mod pożittiv bħal tau.Skont l-affinità ta 'αS għal polycations u r-rata ta' tnaqqis tal-valenza tan-netwerk tal-koagulazzjoni, l-emboli jgħaddu minn ġelazzjoni jew coalescence mgħaġġla segwita minn aggregazzjoni tal-amilojde bil-mod.Billi ngħaqqdu sett ta 'tekniki bijofiżiċi avvanzati, stajna nikkaratterizzaw is-separazzjoni tal-fażi αS/Tau likwidu-likwidu u nidentifikaw il-fatturi ewlenin li jwasslu għall-formazzjoni ta' aggregati eteroġenji li fihom iż-żewġ proteini f'kondensat ta 'proteina likwida.
Minbarra l-kompartimenti tal-membrana, is-separazzjoni spazjali fiċ-ċelluli tista 'tinkiseb ukoll bil-formazzjoni ta' korpi densi b'ħafna proteini, likwidu li jissejħu kondensati jew qtar bijomolekulari, permezz ta 'proċess magħruf bħala separazzjoni tal-fażi likwidu-likwidu (LLPS).Dawn il-qtar huma ffurmati minn interazzjonijiet temporali multivalenti, ġeneralment bejn proteini jew proteini u RNA, u jservu varjetà ta 'funzjonijiet fi kważi s-sistemi ħajjin kollha.Numru kbir ta 'proteini kapaċi LLP juru sekwenzi ta' kumplessità baxxa li huma ferm diżordinati fin-natura u fil-formazzjoni ta 'kondensati bijomolekulari3,4,5.Bosta studji sperimentali wrew in-natura flessibbli, ħafna drabi diżordinata u multivalenti tal-proteini li jiffurmaw dawn il-kondensati li jixbħu likwidi, għalkemm ftit hu magħruf dwar id-determinanti molekulari speċifiċi li jikkontrollaw it-tkabbir u l-maturazzjoni ta’ dawn il-kondensati għal għamla aktar solida. Stat..
Id-dejta l-ġdida tappoġġja l-ipoteżi li LLPS aberranti mmexxija mill-proteini u t-trasformazzjoni ta 'qtar fi strutturi solidi jistgħu jkunu mogħdijiet ċellulari rilevanti li jwasslu għall-formazzjoni ta' aggregati tossiċi li ma jinħallux li ħafna drabi huma karatteristiċi ta 'mard deġenerattiv.Ħafna proteini intrinsikament diżordinati (IDPs) assoċjati ma 'LLPS, ħafna drabi ċċarġjati ħafna u flessibbli, ilhom assoċjati ma' newrodeġenerazzjoni permezz tal-proċess ta 'aggregazzjoni tal-amilojde.B'mod partikolari, kondensati bijomolekulari IDP bħal FUS7 jew TDP-438 jew proteini b'dominji kbar ta 'kumplessità baxxa bħal hnRNPA19 intwerew li jixjieħu f'forom simili ta' ġel jew saħansitra solidi permezz ta 'proċess imsejjaħ fluwidizzazzjoni.kompost.għal transizzjoni ta' fażi solida (LSPT) bħala funzjoni taż-żmien jew bi tweġiba għal ċerti modifiki ta' wara t-traduzzjoni jew mutazzjonijiet patoloġikament sinifikanti1,7.
IDP ieħor assoċjat ma 'LLPS in vivo huwa Tau, proteina diżordinata assoċjata mal-mikrotubuli li l-aggregazzjoni tal-amilojde tagħha ġiet implikata fil-marda ta' Alzheimer10 iżda reċentement ġiet implikata wkoll fil-marda ta 'Parkinson (PD) u proteinopatiji nukleari sinaptiċi oħra 11, 12, 13 huma relatati.Tau intwera li jiddissoċja spontanjament mis-soluzzjoni/ċitoplasma minħabba interazzjonijiet elettrostatiċi favorevoli14, li jirriżulta fil-formazzjoni ta 'qtar arrikkit bit-tau magħrufa bħala coacervates elettrostatiċi.Ġie osservat ukoll li dan it-tip ta’ interazzjoni mhux speċifika hija l-forza li tmexxi wara ħafna kondensati bijomolekulari fin-natura15.Fil-każ ta 'proteina tau, aggregazzjoni elettrostatika tista' tiġi ffurmata b'aggregazzjoni sempliċi, li fiha reġjuni ċċarġjati b'mod oppost tal-proteina jikkawżaw il-proċess ta 'qsim, jew b'aggregazzjoni kumplessa permezz ta' interazzjoni ma 'polimeri ċċarġjati b'mod negattiv bħall-RNA.
Riċentement, α-synuclein (αS), IDP amilojde implikat fil-PD u mard newrodeġenerattiv ieħor magħruf kollettivament bħala sinukleinopatija17,18, intwera f'mudelli ċellulari u annimali19,20 ikkonċentrat f'kondensati ta 'proteini b'imġieba bħal fluwidu.Studji in vitro wrew li αS jgħaddi minn LLPS permezz ta 'aggregazzjoni sempliċi permezz ta' interazzjonijiet predominantement idrofobiċi, għalkemm dan il-proċess jeħtieġ konċentrazzjonijiet ta 'proteini eċċezzjonalment għoljin u ħinijiet ta' inkubazzjoni atipikament twal19,21.Jekk il-kondensati li fihom αS osservati in vivo humiex iffurmati minn dan jew proċessi LLPS oħra tibqa 'kwistjoni ewlenija mhux solvuta.Bl-istess mod, għalkemm l-aggregazzjoni tal-amilojde αS ġiet osservata fin-newroni fil-PD u sinukleinopatiji oħra, il-mekkaniżmu eżatt li bih αS jgħaddi minn aggregazzjoni tal-amilojde intraċellulari għadu mhux ċar, peress li l-espressjoni żejda ta 'din il-proteina ma tidhirx li tixpruna dan il-proċess waħdu.Ħafna drabi hija meħtieġa ħsara ċellulari addizzjonali, li tissuġġerixxi li ċerti postijiet ċellulari jew mikroambjenti huma meħtieġa għar-rinukleazzjoni ta 'assemblaġġi ta' amilojdi αS intraċellulari.Ambjent ċellulari wieħed li huwa partikolarment suxxettibbli għall-aggregazzjoni jista' jkun l-intern tal-kondensati tal-proteini 23 .
Interessanti, αS u tau nstabu li jikko-lokalizzaw f'inklużjonijiet ta 'mard karatteristiċi fil-bnedmin bil-marda ta' Parkinson u sinukleinopatiji oħra 24,25 u esperimenti rrappurtaw relazzjoni patoloġika sinerġistika bejn iż-żewġ proteini 26,27 li jissuġġerixxu relazzjoni potenzjali bejn l-aggregazzjoni αS u tau f'mard newrodeġenerattiv.mard.αS u tau instabu li jinteraġixxu u jippromwovu l-aggregazzjoni ta 'xulxin in vitro u in vivo 28,29 u aggregati eteroġenji komposti minn dawn iż-żewġ proteini ġew osservati fl-imħuħ ta' pazjenti b'synucleinopathies 30 .Madankollu, ftit hu magħruf dwar il-bażi molekulari tal-interazzjoni bejn αS u tau u l-mekkaniżmu tal-ko-aggregazzjoni tiegħu.αS ġie rrappurtat li jinteraġixxi ma 'tau permezz ta' attrazzjoni elettrostatika bejn ir-reġjun C-terminal ikkargat b'mod negattiv ħafna ta 'αS u r-reġjun ċentrali b'ħafna proline ta' tau, li huwa wkoll arrikkit f'residwi ċċarġjati b'mod pożittiv.
F'dan l-istudju, nuru li αS jista 'tabilħaqq jiddissoċja fi qtar permezz ta' kondensazzjoni kumplessa elettrostatika fil-preżenza ta 'proteina tau, b'kuntrast mal-interazzjoni tagħha ma' polipeptidi oħra ċċarġjati b'mod pożittiv bħal poly-L-lysine (pLK), u f'dan il-proċess.αS jaġixxi bħala molekula scaffold għan-netwerk tal-qtar.Aħna identifikajna differenzi notevoli fil-proċess ta 'maturazzjoni ta' αS coacervates elettrostatiċi, li huma assoċjati ma 'differenzi fil-valenza u s-saħħa tal-interazzjoni tal-proteini involuti fin-netwerk tal-koaċervat.Interessanti, osservajna ko-aggregazzjoni ta 'proteini amilojdi αS u tau f'koaċervati likwidi ta' ħajja twila u identifikajna xi fatturi ewlenin li jwasslu għal ko-aggregazzjoni ta 'dawn iż-żewġ proteini f'tali coacervates.Hawnhekk niddeskrivu fid-dettall dan il-proċess, li huwa mekkaniżmu molekulari possibbli sottostanti għall-kolokazzjoni ta 'żewġ proteini f'inklużjonijiet speċifiċi għall-mard.
αS għandu denb C-terminal anjoniku ħafna f'pH newtrali (Fig. 1a), u ipoteżijna li jista 'jgħaddi minn LLPS permezz tal-kondensazzjoni ta' kumplessi elettrostatiċi b'molekuli polipeptidi diżordinati polycationic.Aħna użajna poly-L-lysine ta' 100 residwu (pLK) bħala l-molekula mudell tal-bidu minħabba n-natura polimerika ċċarġjata b'mod pożittiv u diżordinat tagħha f'pH newtrali ta' 32. L-ewwel, aħna kkonfermajna li pLK jinteraġixxi mad-dominju Ct ta 'αS permezz ta' spettroskopija tas-Soluzzjoni NMR. (Figura 1b) bl-użu ta 'αS ittikkettat 13C/15N fil-preżenza ta' αS: pLK proporzjonijiet molari dejjem jiżdiedu.L-interazzjoni ta 'pLK mad-dominju Ct ta' αS timmanifesta ruħha f'perturbazzjonijiet tal-bidla kimika u tnaqqis fl-ogħla intensità f'dan ir-reġjun tal-proteina.Interessanti, meta aħna mħallta αS ma pLK f'konċentrazzjoni αS ta 'madwar.5–25 µM fil-preżenza ta’ polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (buffer LLPS tipiku: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) immedjatament għaddejna minn qasam wiesa’ ta’ formazzjoni ta’ proteini .qtar ġew osservati bl-użu ta 'fluworexxenza (WF) u bright-field (BF) mikroskopija (Fig. 1c).1-5 µm qtar li fihom αS ikkonċentrat (miżjud 1 µM AlexaFluor488-tikketta αS, AF488-αS), il-proprjetajiet elettrostatiċi tagħhom jistgħu jiġu derivati ​​mir-reżistenza tagħhom għal 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) u s-sensittività tiegħu għal żieda fil-konċentrazzjoni ta 'NaCl (Fig. 1c).In-natura li tixbaħ il-fluwidu tal-coacervates tal-kumpless elettrostatiku αS/pLK hija murija mill-kapaċità tagħhom li jingħaqdu f'millisekondi (Fig. 1d).Bl-użu tat-turbidimetrija, aħna kkwantifikajna l-formazzjoni ta 'qtar taħt dawn il-kundizzjonijiet, ikkonfermajna n-natura elettrostatika tal-interazzjoni prinċipali assoċjata mal-istabbiltà tagħha (Fig. 1e), u evalwajna l-effett ta' diversi proporzjonijiet tal-polimer fuq il-proċess LLPS (Fig. 1f).Għalkemm il-formazzjoni tal-qtar hija osservata fuq firxa wiesgħa ta 'proporzjonijiet tal-polimeru, il-proċess huwa favorevoli ħafna meta pLK ikun aktar minn αS.LLPs ġew osservati wkoll bl-użu tal-aġent ta 'spostament kimikament differenti dextran-70 (70 kDa) jew bl-użu ta' varjetà ta 'formati ta' kampjuni, inklużi qtar ta 'slajds tal-ħġieġ, bjar tal-mikroplate ta' materjali varji, Eppendorf jew kapillari tal-kwarz.
a Rappreżentazzjoni skematika ta 'reġjuni differenti ta' proteini fil-varjanti WT-αS u ΔCt-αS użati f'dan l-istudju.Id-dominju N-terminal amfipatiku, ir-reġjun li jifforma l-amyloid idrofobiku (NAC), u d-dominju C-terminal iċċarġjat b'mod negattiv huma murija bil-blu, oranġjo u aħmar, rispettivament.Il-mappa Net Charge Per Residual (NCPR) ta' WT-αS tidher.b Analiżi NMR ta 'l-interazzjoni αS/pLK fin-nuqqas ta' ċapep makromolekulari.Hekk kif tiżdied il-konċentrazzjoni ta 'pLK (proporzjonijiet molari αS:pLK ta' 1:0.5, 1:1.5, u 1:10 huma murija b'aħdar ċar, aħdar u aħdar skur, rispettivament).c Coacervate αS/pLK (proporzjon molari 1:10) f'25 µM (1 µM AF488-tikkettat αS jew Atto647N-tikketta pLK għall-immaġini WF) fil-buffer LLPS (fuq) jew supplimentat b'500 mM NaCl (qiegħ xellug) jew wara 110 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; qiegħ il-lemin).Skala bar = 20 µm.d Immaġini mikroskopiċi rappreżentattivi ta 'fużjoni ta' qtar BF ta 'αS/pLK (proporzjon molari 1:10) f'konċentrazzjoni ta' 25 μM;il-vleġeġ jindikaw l-għaqda ta' qtar individwali (vleġeġ ħomor u sofor) f'qatra ġdida (vleġġa oranġjo) fi żmien 200 ms).Skala bar = 20 µm.e It-tifrix tad-dawl (f'350 nm) Aggregazzjoni αS/pLK fil-buffer LLPS qabel u wara ż-żieda ta' 500 mM NaCl jew 10% 1,6-HD f'25 µM αS (N = 3 repliki tal-kampjun, devjazzjoni medja u standard indikata wkoll).f Immaġini BF (fuq) u analiżi tat-tifrix tad-dawl (f'350 nm, qiegħ) ta 'aggregazzjoni αS/pLK f'25 μM αS b'żieda fil-proporzjon molari αS:pLK (N = 3 repliki tal-kampjun, devjazzjoni medja u standard indikata wkoll).Skala bar = 10 µm.Il-bar tal-iskala fuq immaġini waħda tindika l-iskala tal-immaġini kollha f'pannell wieħed.Data mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta 'fajls ta' data mhux ipproċessata.
Ibbażat fuq l-osservazzjonijiet tagħna ta’ kondensazzjoni kumplessa elettrostatika αS/pLK u osservazzjonijiet preċedenti ta’ αS bħala molekula tal-klijent tal-kondensat tau/RNA permezz ta’ interazzjoni diretta ma’ tau31, ipotizzajna li αS u tau jistgħu jissegregaw flimkien mas-solvent fin-nuqqas ta’ RNA kondensazzjoni.permezz ta 'kumplessi elettrostatiċi, u αS hija l-proteina scaffold f'αS/Tau coacervates (ara d-distribuzzjoni ta' charge tau fil-Figura 2e).Aħna osservajna li meta 10 μM αS u 10 μM Tau441 (li fihom 1 μM AF488-αS u 1 μM Atto647N-Tau, rispettivament) tħalltu flimkien fil-buffer LLPS, huma faċilment iffurmaw aggregati ta 'proteini li fihom iż-żewġ proteini, kif jidher mill-mikroskopija WF.(Fig. 2a).Il-kolokazzjoni taż-żewġ proteini fil-qtar ġiet ikkonfermata permezz ta 'mikroskopija konfokali (CF) (Fig. 1a Supplimentari).Imġieba simili ġiet osservata meta dextran-70 intuża bħala aġent ta 'aggregazzjoni (Fig. 1c Supplimentari).Bl-użu ta 'PEG jew dextran bit-tikketta FITC, sibna li ż-żewġ aġenti tal-iffullar kienu mqassma b'mod uniformi madwar il-kampjuni, u ma wrew la segregazzjoni u lanqas assoċjazzjoni (Fig. 1d Supplimentari).Pjuttost, jissuġġerixxi li f'din is-sistema jippromwovu separazzjoni tal-fażijiet permezz ta 'effetti ta' iffullar makromolekulari, peress li PEG huwa aġent ta 'iffullar preferenzjali stabbli, kif jidher f'sistemi LLP oħra33,34.Dawn il-qtar b'ħafna proteini kienu sensittivi għal NaCl (1 M) iżda mhux għal 1,6-HD (10% v / v), li jikkonfermaw il-proprjetajiet elettrostatiċi tagħhom (Figura Supplimentari 2a, b).L-imġieba fluwidu tagħhom ġiet ikkonfermata billi osservaw avvenimenti ta 'qtar li jingħaqdu millisekondi bl-użu ta' mikroskopija BF (Fig. 2b).
a Immaġini tal-mikroskopija Confocal (CF) ta 'αS/Tau441 jikkoaċervaw fil-buffer LLPS (10 μM ta' kull proteina, 0.5 μM ta 'αS tikketta AF488 u Tau441 tikketta Atto647N).b Immaġini rappreżentattivi ta 'kuntrast ta' interferenza differenzjali (DIC) ta 'avvenimenti ta' fużjoni ta 'qtar αS/Tau441 (10 μM għal kull proteina).c Dijagramma tal-fażi bbażata fuq it-tifrix tad-dawl (f'350 nm) ta' Tau441 LLPS (0–15 µM) fl-assenza (xellug) jew preżenza (lemin) ta' 50 µM αS.Kuluri aktar sħan jindikaw aktar tifrix.d Txerred tad-dawl ta' kampjuni αS/Tau441 LLPS b'konċentrazzjoni αS dejjem tiżdied (Tau441 f'5 µM, N = 2–3 repetizzjonijiet tal-kampjuni kif indikat).e Rappreżentazzjoni skematika ta’ xi varjanti ta’ proteina tau u reġjuni differenti tal-proteina użata f’dan l-istudju: dominju N-terminal iċċarġjat b’mod negattiv (aħmar), reġjun b’ħafna proline (blu), dominju li jgħaqqad il-mikrotubuli (MTBD, enfasizzat bl-oranġjo), u spirali par li jiffurmaw l-amilojde.reġjuni tal-filament (PHF) li jinsabu fi ħdan l-MTBD (griż).Il-mappa Net Charge Per Residue (NCPR) ta' Tau441 tidher.f Bl-użu ta’ αS tikkettat b’1 µM AF488 u ΔNt-tikkettat bl-Atto647N, bl-użu ta’ αS tikkettat b’1 µM AF488 jew ΔCt-αS fil-preżenza ta’ ΔNt-Tau (fuq, 10 µM għal kull proteina) jew K18 (qiegħ, µM, ) ) ) mikrografi ta' WF ikkondensati f'LLPS jew K18 buffer.Il-vireg tal-iskala f'immaġni waħda jirrappreżentaw l-iskala tal-immaġini kollha f'pannell wieħed (20 µm għall-pannelli a, b u f).Id-dejta mhux ipproċessata għall-pannelli ċ u d hija pprovduta bħala fajls tad-dejta mhux ipproċessata.
Biex tittestja r-rwol ta 'αS f'dan il-proċess LLPS, l-ewwel investigajna l-effett ta' αS fuq l-istabbiltà tal-qtar permezz ta 'nefelometrija billi tuża konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu ta' NaCl (Fig. 2c).Iktar ma tkun għolja l-konċentrazzjoni tal-melħ fil-kampjuni li fihom αS, iktar ikunu għoljin il-valuri tat-tifrix tad-dawl (f'350 nm), li jindika r-rwol stabilizzanti tal-αS f'din is-sistema LLPS.Effett simili jista 'jiġi osservat billi tiżdied il-konċentrazzjoni αS (u għalhekk il-proporzjon αS:Tau441) għal madwar.Żieda ta '10 darbiet relattiva għall-konċentrazzjoni tau (5 µM) (Fig. 2d).Biex nuru li αS hija proteina scaffold f'coacervates, iddeċidejna li ninvestigaw l-imġieba tal-mutant Tau imfixkel bl-LLPS, li m'għandux reġjun N-terminal iċċarġjat b'mod negattiv (residwi 1-150, ara Fig. 2e) imsejjaħ ΔNt-Tau.Il-mikroskopija u n-nefelometrija WF ikkonfermaw li ΔNt-Tau innifsu ma għaddax minn LLPS (Fig. 2f u Fig. 2d Supplimentari), kif irrappurtat qabel 14. Madankollu, meta αS ġie miżjud ma 'soluzzjonijiet ta' dispersjoni ta 'dan il-varjant ta' Tau maqtugħ, il-proċess LLPS kien kompletament restawrata b'densità ta 'qtar qrib id-densità ta' qtar ta 'soluzzjonijiet ta' daqs sħiħ ta 'Tau u αS taħt kundizzjonijiet u konċentrazzjonijiet ta' proteini simili.Dan il-proċess jista 'jiġi osservat ukoll taħt kundizzjonijiet ta' iffullar makromolekulari baxx (Fig. 2c Supplimentari).Ir-rwol tar-reġjun αS C-terminal, iżda mhux it-tul kollu tiegħu, fil-proċess LLPS intwera permezz ta 'inibizzjoni tal-formazzjoni ta' qtar bl-użu ta 'varjant αS maqtugħ C-terminal nieqes minn residwi 104-140 (Fig. 1a) tal- (ΔCt- αS) proteina (Fig. 2f u Fig. Supplimentari 2d).Il-kolokazzjoni ta 'αS u ΔNt-Tau ġiet ikkonfermata permezz ta' mikroskopija ta 'fluworexxenza konfokali (Fig. 1b Supplimentari).
Biex jiġi ttestjat aktar il-mekkaniżmu LLPS bejn Tau441 u αS, intuża varjant Tau addizzjonali, jiġifieri l-framment tal-qalba tal-filament helical paired (PHF) fid-dominju li jgħaqqad il-mikrotubuli (MTBD), li jekk ikun fih erba’ oqsma ripetuti karatteristiċi, komunement magħrufa wkoll. bħala l-framment K18 (ara Fig. 2e).Ġie rrappurtat reċentement li αS jorbot b'mod preferenzjali ma 'proteina tau li tinsab f'dominju b'ħafna proline f'sekwenza li tippreċedi d-dominju li jgħaqqad il-mikrotubuli.Madankollu, ir-reġjun PHF huwa wkoll għani f'residwi ċċarġjati b'mod pożittiv (ara l-Figura 2e), speċjalment lisina (residwi 15%), li wassalna biex nittestjaw jekk dan ir-reġjun jikkontribwixxix ukoll għall-kondensazzjoni tal-kumpless αS/Tau.Aħna osservajna li K18 waħdu ma setax jikkawża LLPS f'konċentrazzjonijiet sa 100 μM taħt il-kundizzjonijiet ittestjati (buffer LLPS b'15% PEG jew 20% dextran) (Figura 2f).Madankollu, meta żidna 50 µM αS għal 50 µM K18, ġiet osservata formazzjoni rapida ta 'qtar ta' proteini li fihom K18 u αS permezz ta 'nefelometrija (Fig. Supplimentari 2d) u mikroskopija WF (Fig. 2f).Kif mistenni, ΔCt-αS ma setgħetx tirrestawra l-imġieba LLPS ta 'K18 (Fig. 2f).Aħna ninnotaw li l-aggregazzjoni αS/K18 teħtieġ konċentrazzjonijiet ta 'proteini kemmxejn ogħla biex tinduċi LLPS meta mqabbla ma' αS/ΔNt-Tau jew αS/Tau441, affarijiet oħra jkunu ugwali.Dan huwa konsistenti ma 'interazzjoni aktar b'saħħitha tar-reġjun C-terminal αS mad-dominju Tau b'ħafna proline meta mqabbel mad-dominju li jorbot lill-mikrotubuli, kif deskritt qabel 31 .
Minħabba li ΔNt-Tau ma jistax iwettaq LLPS fin-nuqqas ta 'αS, għażilna dan il-varjant Tau bħala mudell għall-karatterizzazzjoni ta' αS/Tau LLPS minħabba s-sempliċità tiegħu f'sistemi LLPS b'Tau full-length (isotip, Tau441/Tau441).bi proċessi ta' aggregazzjoni kumplessi (eterotipiċi, αS/Tau441).Aħna qabblu l-grad ta 'aggregazzjoni αS (bħala parti mill-proteina tal-fażi kondensata, fαS,c) fis-sistemi αS/Tau u αS/ΔNt-Tau permezz ta' ċentrifugazzjoni u analiżi SDS-PAGE ta 'fażi mxerrda (ara 2e), sibna valuri simili ħafna għall-proteini kollha fl-istess konċentrazzjoni.B'mod partikolari, ksibna fαS,c 84 ± 2% u 79 ± 7% għal αS/Tau u αS/ΔNt-Tau, rispettivament, li jissuġġerixxu li l-interazzjoni eterotipika bejn αS u tau hija superjuri għall-interazzjoni bejn molekuli tau.bejn.
L-interazzjoni ma 'diversi polycations u l-effett tal-proċess ta' kondensazzjoni fuq il-kinetika αS ġew studjati l-ewwel bil-metodu ta 'rkupru tal-fluworexxenza wara photobleaching (FRAP).Aħna ttestjajna αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau u αS/pLK coacervates (100 μM αS supplimentati b'2 μM αS AF488-αS u 100 μM Tau441 jew ΔNt-Tau jew 1 mM pLK).Id-dejta nkisbet fl-ewwel 30 minuta wara li tħallat il-komponenti tal-kampjun.Minn stampi FRAP rappreżentattivi (Fig. 3a, kondensazzjoni αS/Tau441) u l-kurvi tal-kors tal-ħin korrispondenti tagħhom (Fig. 3b, Fig. 3 Supplimentari), wieħed jista 'jara li l-kinetika αS hija simili ħafna għal dawk ta' koacervati Tau441.u ΔNt-Tau, li hija ħafna aktar mgħaġġla bil-pLK.Il-koeffiċjenti ta' diffużjoni kkalkulati għal αS ġewwa l-koaċervat skont FRAP (kif deskritt minn Kang et al. 35) huma D = 0.013 ± 0.009 µm2/s u D = 0.026 ± 0.008 µm2/s għal αS/Tau441 u αNt-S/Δ is-sistema αS/.pLK, Tau, u D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, rispettivament (Fig. 3c).Madankollu, il-koeffiċjent ta 'diffużjoni αS fil-fażi mxerrda huwa bosta ordnijiet ta' kobor ogħla mill-fażijiet kondensati kollha, kif iddeterminat mill-Ispettroskopija ta 'Korrelazzjoni tal-Fworexxenza (FCS, ara Fig. 3 Supplimentari) taħt l-istess kundizzjonijiet (buffer LLPS) iżda fin-nuqqas ta' polycations (D = 8 ± 4 µm2/s).Għalhekk, il-kinetika tat-traduzzjoni αS hija mnaqqsa b'mod sinifikanti fil-koaċervati meta mqabbla ma 'proteini fil-fażi mxerrda minħabba effetti ta' iffullar molekulari pronunzjati, għalkemm il-koaċervati kollha jżommu proprjetajiet li jixbħu likwidu matul l-ewwel nofs siegħa wara l-formazzjoni tagħhom, b'kuntrast mal-fażi tau.kinetika aktar mgħaġġla fil-kondensat pLK.
a–c Analiżi FRAP tad-dinamika αS (2% αS tikkettat AF488) f'koacervati elettrostatiċi.Immaġini rappreżentattivi ta 'assaġġi αS/Tau441 FRAP fi tliet kopji huma murija f'(a), fejn ċrieki ħomor jindikaw żoni dekolorizzati.Il-bar tal-iskala hija 5 µm.b Kurvi medji FRAP u (c) koeffiċjenti ta’ diffużjoni kkalkulati (D) għal 5–6 (N) qtar differenti minn tliet esperimenti li jużaw 100 µM αS u konċentrazzjonijiet ekwimolari ta’ Tau441 (aħmar) jew ΔNt-Tau (blu) jew pLK (aħdar) f'għaxar darbiet il-konċentrazzjoni ta 'LLPS.Id-devjazzjoni standard tal-kurva FRAP tidher b'kulur sfumat.Għal tqabbil, il-koeffiċjent ta 'diffużjoni αS fil-fażi mxerrda ġie ddeterminat fi tliet kopji bl-użu ta' spettroskopija ta 'korrelazzjoni ta' fluworexxenza (FCS) (ara Figura Supplimentari 3 u metodi għal aktar informazzjoni).d Spettri EPR kontinwi X-band ta '100 μM TEMPOL-122-αS f'buffer LLPS mingħajr ebda polycation (iswed) jew fil-preżenza ta' 100 μM Tau441 (aħmar) jew ΔNt-Tau (blu) jew 1 mM pLK (aħdar).Id-daħla turi ħarsa eżaltata tal-linji qawwija tal-kamp fejn iseħħu l-aktar bidliet drammatiċi.e Kurvi li jorbtu ta '50 μM TEMPOL-122-αS b'diversi polycations fin-nuqqas ta' LLPS (l-ebda PEG).L-amplitudni mnaqqsa tal-medda III meta mqabbla mal-medda II (IIII/III) tal-ispettru EPR normalizzat hija murija li żżid il-proporzjonijiet molari ta 'Tau441 (aħmar), ΔNt-Tau (blu) u pLK (aħdar).Linji kkuluriti juru tajbin għad-dejta bl-użu ta' mudell ta' rbit mhux maħdum b'n siti ta' rbit identiċi u indipendenti fuq kull kurva.Id-dejta mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta' fajls ta' dejta mhux ipproċessata.
Bħala komplement, investigajna d-dinamika ta 'αS f'diversi coacervates bl-użu ta' tikkettjar dirett ta 'spin (SDSL) u reżonanza paramanjetika tal-elettroni kontinwa (CW-EPR).Dan il-metodu wera li huwa utli ħafna fir-rappurtar tal-flessibilità u d-dinamika tal-IDP b'riżoluzzjoni residwa realistika36,37,38.Għal dan il-għan, bnejna residwi ta 'cysteine ​​f'mutanti Cys singoli u użajna s-sonda spin 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Id-derivattivi tal-maleimide jittikkettjawhom.B'mod aktar speċifiku, daħħalna sondi TEMPOL fil-pożizzjoni 122 jew 24 αS (TEMPOL-122-αS u TEMPOL-24-αS).Fl-ewwel każ, aħna nimmiraw ir-reġjun C-terminal tal-proteina, li hija involuta fl-interazzjoni mal-polikatazzjonijiet.Minflok, il-pożizzjoni 24 tista 'tagħtina informazzjoni dwar id-dinamika ġenerali tal-proteini fil-kondensat.Fiż-żewġ każijiet, is-sinjali EPR miksuba għall-proteini tal-fażi mxerrda kienu jikkorrispondu għal radikali nitrossidu fl-istat li jiċċaqlaq malajr.Wara separazzjoni tal-fażi fil-preżenza ta' tau jew pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 jew ΔNt-Tau fi proporzjon ta' 1:1 jew pLK fi proporzjon ta' 1:10), ġiet osservata żieda fl-ogħla intensità relattiva f' l-ispettru EPR ta' αS.Il-linja tat-telf wessgħet, u tindika kinetiċi mnaqqsa ta' orjentazzjoni mill-ġdid ta 'αS fi qtar meta mqabbla ma' proteina f'fażi dilwita (Fig. 3d, Fig. Supplimentari 4a).Dawn il-bidliet huma aktar evidenti fil-pożizzjoni 122. Filwaqt li fil-pożizzjoni 24 il-preżenza ta 'pLK ma affettwatx il-kinetika tas-sonda, fil-pożizzjoni 122 il-forma tal-linja spettrali nbidlet b'mod sinifikanti (Figura Supplimentari 4a).Meta ppruvajna nimudellaw l-ispettri fil-pożizzjoni 122 ta 'żewġ sistemi αS/polication bl-użu tal-mudell iżotropiku (Figura Supplimentari 5a) użat komunement biex jiddeskrivi d-dinamika ta' IDP38,39 bit-tikketta spin, ma stajniex nibnu mill-ġdid l-ispettri sperimentali..Simulazzjoni spettrali tal-pożizzjoni ta '24 spins kuntrasti (Figura Supplimentari 5a).Dan jissuġġerixxi li hemm pożizzjonijiet preferenzjali fl-ispazju ta 'konfigurazzjonijiet ta' spin tar-reġjun C-terminal ta 'αS fil-preżenza ta' polycations.Meta tikkunsidra l-frazzjoni ta' αS fil-fażi kkondensata taħt kundizzjonijiet EPR sperimentali (84 ± 2%, 79 ± 7%, u 47 ± 4% għal αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, u αS/pLK, rispettivament—ara Supplimentari Fig. 2e ta 'analiżi tad-dejta c), wieħed jista' jara li t-twessigħ misjub mill-metodu EPR jirrifletti prinċipalment l-interazzjoni tar-reġjun C-terminal ta 'αS ma' diversi polycations fil-fażi kondensata (il-bidla ewlenija meta tuża TEMPOL-122- αS), u mhux kondensazzjoni tal-proteini.Żieda fil-mikroviskożità hija osservata fis-sonda.Kif mistenni, l-ispettru EPR tal-proteina taħt kundizzjonijiet oħra għajr LLPS ġie kompletament restawrat meta 1 M NaCl ġie miżjud mat-taħlita (Fig. 4b Supplimentari).B'mod ġenerali, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li l-bidliet misjuba minn CW-EPR jirriflettu prinċipalment l-interazzjoni tar-reġjun C-terminal ta 'αS b'diversi polycations fil-fażi kondensata, u din l-interazzjoni tidher li hija aktar b'saħħitha ma' pLK milli ma 'Tau.
Sabiex niksbu aktar informazzjoni strutturali dwar il-proteini fil-coacervate, iddeċidejna li nistudjaw is-sistema LLPS billi tuża NMR f'soluzzjoni.Madankollu, nistgħu niskopru biss il-frazzjoni αS li tibqa 'fil-fażi mxerrda, li tista' tkun dovuta għal dinamika ta 'proteini mnaqqsa ġewwa l-coacervate u fażi densa fil-qiegħ tas-soluzzjoni fl-analiżi NMR.Meta analizzajna l-istruttura u d-dinamika tal-proteina li fadal fil-fażi mxerrda tal-kampjun LLPS bl-użu tal-NMR (Figura Supplimentari 5c, d), aħna ndunajna li l-proteina ġabet ruħha kważi b’mod identiku fil-preżenza ta’ pLK u ΔNt-Tau, it-tnejn ta’ li kienu fl-istruttura u d-dinamika sekondarja tas-sinsla tal-proteina, żvelati minn esperimenti fuq bidla kimika sekondarja u rilassament R1ρ.Id-dejta tal-NMR turi li s-C-terminus ta 'αS isofri telf sinifikanti ta' flessibilità konformazzjonali filwaqt li jżomm in-natura diżordinata tiegħu, bħall-bqija tas-sekwenza tal-proteini, minħabba l-interazzjonijiet tiegħu mal-polikatazzjonijiet.
Peress li t-twessigħ tas-sinjal CW-EPR osservat fil-fażi kondensata TEMPOL-122-αS jirrifletti l-interazzjoni tal-proteina ma 'polikatazzjonijiet, wettaqna titrazzjoni EPR biex nevalwaw l-affinità ta' rbit ta 'αS għal diversi polycations fin-nuqqas ta' LLPS (l-ebda akkumulazzjoni ta ' Buffer LLPS), li jissuġġerixxi li l-interazzjonijiet huma l-istess f'fażijiet dilwiti u kkonċentrati (li hija kkonfermata mid-dejta tagħna, Fig. 4a Supplimentari u Fig. 6 Supplimentari).L-għan kien li jara jekk il-koaċervati kollha, minkejja l-proprjetajiet komuni tagħhom bħal fluwidi, jurux xi mġiba differenzjali sottostanti fil-livell molekulari.Kif mistenni, l-ispettru EPR twessa 'biż-żieda fil-konċentrazzjoni tal-polikatjoni, li jirrifletti tnaqqis fil-flessibbiltà molekulari minħabba interazzjonijiet molekulari tal-imsieħba kollha tal-interazzjoni kważi sasaturazzjoni (Fig. 3e, Fig. Supplimentari 6).pLK kiseb din is-saturazzjoni bi proporzjon molari aktar baxx (polication:αS) meta mqabbel ma 'ΔNt-Tau u Tau441.Fil-fatt, paragun tad-dejta ma' mudell ta' rbit approssimattiv li jassumi n siti ta' rbit identiċi u indipendenti wera li l-kostanti ta' dissoċjazzjoni apparenti ta' pLK (~ 5 μM) hija ordni ta' kobor inqas minn dik ta' Tau441 jew ΔNt-Tau (~ 50 μM). ).µM).Għalkemm din hija stima approssimattiva, dan jissuġġerixxi li αS għandu affinità ogħla għal polycations aktar sempliċi b'reġjuni ta 'ċarġ pożittiv kontinwu.Minħabba din id-differenza fl-affinità bejn αS u diversi polycations, ipotizzajna li l-proprjetajiet likwidi tagħhom jistgħu jinbidlu b'mod differenti maż-żmien u għalhekk ibatu minn proċessi LSPT differenti.
Minħabba l-ambjent iffullar ħafna fi ħdan il-coacervate tal-proteina u n-natura amilojde tal-proteina, osservajna l-imġieba tal-coacervate maż-żmien biex niskopru proċessi LSPT possibbli.Bl-użu tal-mikroskopija BF u CF (Figura 4), osservajna li αS/Tau441 jikkoaċervaw fil-biċċa l-kbira fis-soluzzjoni, u jiffurmaw qtar kbar li jikkuntattjaw u jixxarrbu l-wiċċ fil-qiegħ tal-bir/slide bħala qtar sħiħ, kif mistenni (Fig Supplimentari .7d);nsejħu dawn l-istrutturi ffurmati fil-qiegħ "ċattri tal-proteini".Dawn l-istrutturi baqgħu fluwidi peress li żammew il-ħila li jingħaqdu (Fig. 7b Supplimentari) u setgħu jidhru għal diversi sigħat wara li LLPS ġie attivat (Fig. 4 u Fig. 7c Supplimentari).Aħna osservajna li l-proċess tat-tixrib huwa ppreferut fuq il-wiċċ ta 'materjali idrofiliċi aktar milli idrofobiċi (Fig. 7a Supplimentari), kif mistenni għal koaċervati elettrostatiċi b'karigi żbilanċjati u b'hekk potenzjali għolja tal-wiċċ elettrostatiku.Notevolment, il-koalescence u rafting αS/ΔNt-Tau tnaqqsu b'mod sinifikanti, filwaqt li l-kondensati αS/pLK tnaqqsu b'mod sinifikanti (Fig. 4).Matul iż-żmien qasir ta 'inkubazzjoni, il-qtar αS/pLK setgħu jingħaqdu u jxarrbu l-wiċċ idrofiliku, iżda dan il-proċess waqaf malajr u wara 5 sigħat ta' inkubazzjoni, ġew osservati biss avvenimenti ta 'koalescence limitati u l-ebda tixrib.– transizzjoni ġel-dripp.
BF rappreżentattivi (pannelli fuq skala griża) u CF (pannelli tal-lemin, αS bit-tikketta AF488 bl-aħdar) ta’ kampjuni ta’ coacervate li fihom 100 µM αS (1% tikketta fluworexxenti) fil-buffer LLPS fil-preżenza ta’ immaġini mikroskopiċi ta’ 100 µM Tau441 (fuq) fluworexxenza ΔN -Tau (ċentru) jew 1 mM pLK (qiegħ) f'ħinijiet ta 'inkubazzjoni differenti u għoli fokali (z, distanza mill-qiegħ tal-pjanċa sew).L-esperimenti ġew ripetuti 4-6 darbiet indipendentement minn xulxin bl-istess riżultati.Il-koaċervati αS/Tau441 huma mxarrba wara 24 siegħa, u jiffurmaw ċattri akbar mill-immaġni.Il-bar tal-iskala għall-immaġini kollha hija 20 µm.
Imbagħad staqsejna jekk il-pools kbar ta 'proteini simili għal fluwidu ffurmati f'αS/Tau441 LLPS iwasslux għal aggregazzjoni tal-amilojde ta' xi waħda mill-proteini studjati.Segwejna l-maturazzjoni ta 'qtar αS/Tau441 maż-żmien bil-mikroskopija WF taħt l-istess kundizzjonijiet bħal hawn fuq, iżda bl-użu ta' αS tikkettat b'1 μM AF488 u Tau441 bit-tikketta Atto647N (Fig. 5a).Kif mistenni, osservajna lokalizzazzjoni sħiħa tal-proteini matul il-proċess ta 'maturazzjoni.Interessanti, minn ca.Wara 5 sigħat, ġew osservati strutturi mhux ċirkolari aktar intensi ġewwa ċ-ċattri, li nsejħulhom "punti", li wħud minnhom kienu colocalizzati ma 'αS, u xi wħud ġew arrikkit f'Tau441 (Fig. 5a, vleġeġ bojod).Dawn it-tikek dejjem ġew osservati fi ħdan iċ-ċattri b'mod akbar għal αS/ΔNt-Tau milli għal αS/ΔNt-Tau.Ma kien hemm ebda tikek distinti fil-qtar tas-sistemi pLK u Tau inkompetenti għall-fużjoni/tixrib.Biex tittestja jekk dawn it-tbajja' li fihom αS u Tau441 humiex aggregati li jixbħu l-amilojde, għamilna esperiment simili bl-użu tal-mikroskopija CF li fiha Tau441 ġie ttikkettjat b'Atto647N u 12.5 μM thioflavin-T (ThT) speċifiku għall-amilojde ġie miżjud mill-bidu.żebgħa.Għalkemm it-tbajja 'ThT ta' qtar jew ċattri αS/Tau441 ma ġietx osservata anke wara 24 siegħa ta 'inkubazzjoni (Fig. 5b, ringiela ta' fuq—qtar li jifdal fuq ċattri tal-proteini), strutturi ThT-pożittivi li fihom Atto647N-Tau441 ġewwa ċ-ċattri kienu dgħajfa ħafna.dan jirreplika d-daqs, il-forma, u l-post tat-tikek deskritti qabel (Fig. 5b, ringieli tan-nofs u tal-qiegħ), li jissuġġerixxi li t-tikek jistgħu jikkorrispondu għal aggregati li jixbħu l-amilojdi ffurmati f'koacervati ta 'fluwidu li qed jixjieħu.
WF 25 μM αS f'diversi ħinijiet ta 'inkubazzjoni u għoli fokali (z, distanza mill-qiegħ mhux marbut) fil-preżenza ta' 25 μM Tau441 (1 μM AF488-tikketta αS u Atto647N-tikketta Tau441) f'bir ta 'pjanċa mikroskopju b'buffer LLPS) .Sitt esperimenti ġew ripetuti b'mod indipendenti b'riżultati simili.b Immaġini mikroskopika CF ta '25 μM αS fil-preżenza ta' 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-tikkettat Tau441) u 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Qtar ta 'proteini peżati u ċattri u spots ta' proteina depożitati huma murija fir-ringieli ta 'fuq u tan-nofs, rispettivament.Ir-ringiela ta' isfel turi stampi ta' ċattri u qtar minn 3 repliki indipendenti.Vleġeġ bojod jindikaw tikek ThT-pożittivi fiż-żewġ pannelli.Il-bar tal-iskala għall-immaġini kollha hija 20 µm.
Biex neżaminaw f'aktar dettall il-bidliet fin-netwerk tal-proteini coacervate matul it-tranżizzjoni minn likwidu għal solidu, użajna immaġini ta 'ħajja ta' fluworexxenza (FLIM) u mikroskopija ta 'trasferiment ta' enerġija ta 'reżonanza Förster (FRET) (Figura 6 u Figuri Supplimentari 8 u 9).Aħna ipoteżijna li l-maturazzjoni koaċervata tas-saff fi struttura ta 'proteina aggregata aktar kondensata jew saħansitra solida twassal għal kuntatt eqreb bejn il-proteina u s-sonda fluworexxenti mwaħħla magħha, li potenzjalment tipproduċi effett ta' tkessiħ manifestat f'ħajja mqassra tas-sonda (τ) , kif deskritt qabel40.,41 ,42.Barra minn hekk, għal kampjuni ttikkettjati doppji (AF488 u Atto647N bħala żebgħa donatur FRET u aċċettatur, rispettivament), dan it-tnaqqis f'τ jista 'jkun akkumpanjat ukoll minn kondensazzjoni ta' coacervate u żieda fl-effiċjenza FRET(E) waqt LSPT.Aħna mmonitorjajna l-formazzjoni ta 'ċattra u spot maż-żmien f'kampjuni LLPS αS/Tau441 u αS/ΔNt-Tau (25 µM ta' kull proteina fil-buffer LLPS li fih 1 µM AF488 ittikkettat αS u/jew Atto647N ittikkettat Tau441 jew ΔNt-Tau).Aħna osservajna xejra ġenerali li l-ħajja tal-fluworexxenza tas-sondi AF488 (τ488) u Atto647N (τ647N) naqset kemmxejn hekk kif il-coacervates mmaturaw (Fig. 6 u Supplimentari Fig. 8c).Interessanti, din il-bidla tjiebet b'mod sinifikanti għal tikek fi ħdan ċattri (Fig. 6c), li jindika li seħħet aktar kondensazzjoni ta 'proteini f'tikek.B'appoġġ għal dan, ma ġiet osservata l-ebda bidla sinifikanti fil-ħajja tal-fluworexxenza għal qtar αS / ΔNt-Tau ta' età għal 24 siegħa (Fig. 8d Supplimentari), li tissuġġerixxi li l-ġelazzjoni tal-qtar hija proċess distint minn spotting u li mhuwiex akkumpanjat minn riorganizzazzjoni molekulari sinifikanti. fi ħdan koaċervati.Għandu jiġi nnutat li t-tikek għandhom daqsijiet differenti u kontenut varjabbli f'αS, speċjalment għas-sistema αS/Tau441 (Fig. 8e Supplimentari).It-tnaqqis fil-ħajja tal-fluworexxenza spot kien akkumpanjat minn żieda fl-intensità, speċjalment għal Atto647N ittikkettat Tau441 (Fig. 8a Supplimentari), u effiċjenzi FRET ogħla kemm għas-sistemi αS/Tau441 kif ukoll αS/ΔNt-Tau, li jindikaw aktar kondensazzjoni f'LLPS Ħames sigħat. wara li tqajjem, il-proteini ġewwa l-elettriku statiku ikkondensaw.Meta mqabbel ma 'αS/ΔNt-Tau, osservajna valuri τ647N aktar baxxi u kemmxejn ogħla τ488 f'spots αS/Tau441, akkumpanjati minn valuri FRET aktar baxxi u aktar inomoġenji.Possibbilment, dan jista 'jkun relatat mal-fatt li fis-sistema αS/Tau441, l-abbundanza osservata u mistennija ta' αS fl-aggregati hija aktar eteroġenja, ħafna drabi substokjometrika meta mqabbla ma 'Tau, peress li Tau441 innifsu jista' wkoll jgħaddi minn LLPS u aggregazzjoni (Figura 8e Supplimentari) .Madankollu, il-grad ta 'koalescence ta' qtar, formazzjoni ta 'ċattra, u, importanti, aggregazzjoni ta' proteini fi koacervati li jixbħu likwidu huwa massimu meta kemm Tau441 kif ukoll αS huma preżenti.
a Stampi tal-mikroskopija tal-fluworexxenza tul il-ħajja (FLIM) ta' αS/Tau441 u αS/ΔNt-Tau f'25 μM ta' kull proteina (1 μM AF488-tikkettat αS u 1 μM Atto647N-tikkettat Tau441 jew ΔNt-Tau buffer) fi.Il-kolonni juru stampi rappreżentattivi ta 'kampjuni LLPS f'ħinijiet ta' maturazzjoni differenti (30 min, 5 sigħat u 24 siegħa).Il-qafas aħmar juri r-reġjun li fih tikek αS/Tau441.It-tul tal-ħajja huma murija bħala vireg tal-kulur.Skala bar = 20 µm għall-immaġini kollha.b Immaġini FLIM imqabbda żżomjata taż-żona magħżula, murija fil-kaxxa l-ħamra fil-pannell a.Il-firxiet tal-ħajja huma murija bl-użu tal-istess skala tal-kulur bħal fil-pannell a.Skala bar = 5 µm.c Istogrammi li juru AF488 (mehmuża ma’ αS) jew Atto647N (mehmuża ma’ Tau) għal speċi ta’ proteini differenti (qtar-D-, raft-R- u speckle-P) identifikati f’immaġini FLIM irreġistrati għal αS-) tul il-ħajja tad-distribuzzjonijiet tal-ħin ta’ Tau441 u Kampjuni ta' koaċervat αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI għal D, 29-44 ROI għal R, u 21-51 ROI għall-punti).Il-valuri medji u medjani huma murija bħala kwadri sofor u linji suwed ġewwa kaxxi, rispettivament.Il-limiti t'isfel u ta 'fuq tal-kaxxa jirrappreżentaw l-ewwel u t-tielet kwartili, rispettivament, u l-valuri minimi u massimi fil-medda interkwartili ta' 1.5 darbiet (IQR) huma murija bħala whiskers.Outliers huma murija bħala djamanti suwed.Is-sinifikat statistiku bejn pari ta 'distribuzzjonijiet ġie determinat bl-użu ta' test t b'żewġ kampjuni, billi wieħed jassumi varjanzi mhux ugwali.Il-valuri p tat-test t b'żewġ denbu jintwerew b'asterisk għal kull par ta' dejta mqabbla (* valur p > 0.01, ** valur p > 0.001, *** valur p > 0.0001, **** valur p > 0.00001), ns Jindika negliġibbiltà (valur p > 0.05).Il-valuri p eżatti huma mogħtija fit-Tabella Supplimentari 1, u d-dejta oriġinali hija ppreżentata bħala fajls ta 'dejta mhux maħduma.
Biex nuru aktar in-natura ta 'speckles/aggregati li jixbħu l-amilojde, ittrattajna kampjuni ta' coacervate mhux imtebba għal 24 siegħa b'konċentrazzjonijiet għoljin ta '(1 M) NaCl, li rriżultaw fis-separazzjoni ta' aggregati minn koaċervati ta 'proteini.Meta aggregati iżolati (jiġifieri, soluzzjoni mxerrda ta 'aggregati) ġew osservati bl-użu ta' mikroskopija tal-forza atomika (AFM), aħna osservajna morfoloġija predominantement sferika b'għoli regolari ta 'madwar 15 nm, li għandha t-tendenza li tassoċja taħt kundizzjonijiet ta' konċentrazzjoni għolja ta 'melħ, simili għal l-imġieba ta 'fibri amilojdi tipiċi minħabba l-effett idrofobiku qawwi fuq il-wiċċ (innota li l-fibrili tipikament għandhom għoli ta' ~ 10 nm) (Fig. Supplimentari 10a).Interessanti, meta l-aggregati iżolati ġew inkubati b'ThT f'assaġġ ta' fluworexxenza ThT standard, osservajna żieda drammatika fir-rendiment quantum tal-fluworexxenza ThT, komparabbli ma' dik osservata meta ż-żebgħa ġiet inkubata b'fibrili amilojdi αS tipiċi (Figura Supplimentari 10b), li tissuġġerixxi li l-aggregati koaċervati fihom strutturi bħal amilojdi..Fil-fatt, l-aggregati kienu tolleranti għal konċentrazzjonijiet għolja ta 'melħ iżda sensittivi għal 4 M guanidine chloride (GdnHCl), bħal fibri amilojdi tipiċi (Fig. Supplimentari 10c).
Sussegwentement, analizzajna l-kompożizzjoni tal-aggregati bl-użu ta 'fluworexxenza ta' molekula waħda, spettroskopija ta 'korrelazzjoni / korrelazzjoni inkroċjata ta' fluworexxenza speċifika (FCS/FCCS), u analiżi tat-tifqigħ ta 'skoperta ta' koinċidenza b'żewġ kuluri (TCCD).Għal dan il-għan, aħna iżolati aggregati ffurmati wara 24 siegħa ta 'inkubazzjoni f'100 μl kampjuni LLPS li fihom αS u Tau441 (it-tnejn 25 μM) flimkien ma' 1 μM AF488-tikketta αS u 1 μM Atto647N-tikketta Tau441.Iddilwa s-soluzzjoni aggregata mxerrda li tirriżulta għal stat monomolekulari billi tuża l-istess buffer ħieles mill-PEG u 1 M NaCl (l-istess buffer użat biex tissepara l-aggregati minn coacervate) biex tevita kwalunkwe interazzjoni elettrostatika possibbli bejn LLPS u proteina.Eżempju tat-trajettorja tal-ħin ta 'molekula waħda jista' jidher fil-Fig. 7a.L-analiżi FCCS/FCS (korrelazzjoni inkroċjata, CC u awtokorrelazzjoni, AC) wriet li l-aggregati li fihom αS u tau kienu abbundanti fil-kampjuni (ara l-kurva CC f’Fig. 7b, panel tax-xellug), u qamet eċċess ta’ proteina monomerika residwa bħala riżultat. riżultat tal-proċess ta’ dilwizzjoni (ara l-kurvi AC f’Figura 7b, panew tax-xellug).Esperimenti ta 'kontroll imwettqa taħt l-istess kundizzjonijiet ta' soluzzjoni bl-użu ta 'kampjuni li fihom proteini monomeriċi biss ma wrew l-ebda kurvi CC, u l-kurvi AC jaqblu sew mal-mudell ta' diffużjoni b'komponent wieħed (Eq. 4), fejn proteini monomeriċi għandhom il-koeffiċjenti ta 'diffużjoni mistennija (Fig. 7b). ), panel tal-lemin).Il-koeffiċjent tad-diffużjoni tal-partiċelli aggregati huwa inqas minn 1 µm2/s, u dak tal-proteini monomeriċi huwa madwar 1 µm2/s.50–100 µm/s;il-valuri huma simili għal valuri ppubblikati qabel għal fibri αS amilojdi ivvibrati u αS monomeriċi separatament taħt kundizzjonijiet ta’ soluzzjoni simili44.Meta analizzajna l-aggregati bl-analiżi tal-isplużjoni TCCD (Fig. 7c, panel ta 'fuq), sibna li f'kull aggregat iżolat (αS/Tau heteroaggregate), madwar 60% tal-aggregati misjuba kien fihom kemm αS kif ukoll tau, madwar 30% kien fihom biss tau, madwar 10% αS biss.L-analiżi stojkjometrika tal-eteroaggregati αS/Tau wriet li l-biċċa l-kbira tal-eteroaggregati kienu arrikkit f’tau (stojkjometrija taħt 0.5, in-numru medju ta’ molekuli tau għal kull aggregat huwa 4 darbiet aktar minn molekuli αS), li hija konsistenti max-xogħol tagħna osservat f’FLIM in situ esperimenti..L-analiżi FRET wriet li dawn l-aggregati kien fihom iż-żewġ proteini, għalkemm il-valuri attwali tal-FRET f'dan il-każ mhumiex ta 'importanza kbira, peress li d-distribuzzjoni tal-fluworofori f'kull aggregat kienet każwali minħabba eċċess ta' proteina mhux ittikkettata użata fl-esperiment.Interessanti, meta għamilna l-istess analiżi billi użajna l-varjant Tau defiċjenti ta' aggregazzjoni tal-amilojde matura 45,46 (ara Fig. 11a, b Supplimentari), innutajna li għalkemm l-aggregazzjoni elettrostatika αS kienet l-istess (Fig. 11c, d). l-abbiltà li jiffurmaw aggregati fi ħdan il-coacervate tnaqqset drastikament u FLIM skopra diversi spots f'esperimenti in situ, u kurvi ta 'korrelazzjoni inkroċjata dgħajfa ġew osservati għal kampjuni aggregati iżolati.Madankollu, għal numru żgħir ta 'aggregati misjuba (wieħed minn għaxra biss ta' Tau441), aħna osservajna li kull aggregat kien arrikkit f'αS minn dan il-varjant Tau, b'madwar 50% tal-aggregati misjuba li fihom biss molekuli αS, u αS kien eteroġenju f'eċċess. .aggregati (ara Fig. 11e Supplimentari), b'kuntrast mal-aggregati eteroġenji ġġenerati minn Tau441 (Fig. 6f).Ir-riżultati ta 'dawn l-esperimenti wrew li għalkemm αS innifsu huwa kapaċi jakkumula ma' tau fi ħdan il-coacervate, in-nukleazzjoni tau hija aktar favorevoli taħt dawn il-kundizzjonijiet, u l-aggregati li jixbhu l-amilojdi li jirriżultaw huma kapaċi jaġixxu bħala forma ta 'αS u tau.Madankollu, ladarba tiġi ffurmata qalba b'ħafna tau, interazzjonijiet eterotipiċi bejn αS u tau huma favoriti f'aggregati fuq interazzjonijiet omotipiċi bejn molekuli tau;aħna nosservaw ukoll in-netwerks tal-proteini f'koacervati likwidi αS/tau.
a Traċċi temporali ta' fluworexxenza rappreżentattivi ta' molekuli singoli ta' aggregati iżolati ffurmati f'koacervati elettrostatiċi αS/Tau441.Fqigħ li jikkorrispondu għal coaggregates αS/Tau441 (fqigħ 'l fuq mil-limitu indikat) ġew osservati fi tliet kanali ta' sejbien (emissjoni AF488 u Atto647N wara eċitazzjoni diretta, linji blu u ħomor, emissjoni Atto647N wara eċċitazzjoni indiretta), FRET, linja vjola).b Analiżi FCS/FCCS ta’ kampjun ta’ aggregati iżolati αS/Tau441 miksuba minn LLPS (pannell tax-xellug).Il-kurvi tal-awtokorrelazzjoni (AC) għal AF488 u Atto647N huma murija bil-blu u l-aħmar, rispettivament, u l-kurvi ta 'korrelazzjoni inkroċjata (CC) assoċjati ma' aggregati li fihom iż-żewġ żebgħa huma murija bil-vjola.Il-kurvi AC jirriflettu l-preżenza ta 'speċi ta' proteini monomeriċi u aggregati ttikkettjati, filwaqt li l-kurvi CC juru biss id-diffużjoni ta 'aggregati b'tikketta doppja.L-istess analiżi, iżda taħt l-istess kundizzjonijiet ta 'soluzzjoni bħal f'tikek iżolati, kampjuni li fihom biss αS monomeriku u Tau441 huma murija bħala kontrolli fil-pannell tal-lemin.c Analiżi flash ta 'fluworexxenza ta' molekuli singoli ta 'aggregati iżolati ffurmati f'koacervati elettrostatiċi αS/Tau441.L-informazzjoni għal kull aggregat misjub f'erba 'repetizzjonijiet differenti (N = 152) hija plottjata kontra l-istojkjometrija tagħhom, il-valuri S, u l-effiċjenza FRET (pannell ta' fuq, bar tal-kulur jirrifletti l-okkorrenza).Jistgħu jiġu distinti tliet tipi ta' aggregati: -aggregati ta' αS biss b'S~1 u FRET~0, aggregati ta' Tau biss b'S~0 u FRET~1, u aggregati eteroġenji Tau/αS b'Stimi intermedji S u FRET tal-ammont taż-żewġ proteini markaturi misjuba f'kull aggregat eteroġenju (N = 100) huma murija fil-pannell t'isfel (l-iskala tal-kulur tirrifletti l-okkorrenza).Id-dejta mhux ipproċessata hija pprovduta fil-forma ta' fajls ta' dejta mhux ipproċessata.
Il-maturazzjoni jew it-tixjiħ tal-kondensati tal-proteini likwidi fi strutturi simili għal ġel jew solidi matul iż-żmien ġew irrappurtati li huma involuti f'diversi funzjonijiet fiżjoloġiċi tal-kondensat47 kif ukoll fil-mard, bħala proċess anormali li jippreċedi l-aggregazzjoni tal-amilojde 7, 48, 49. Hawnhekk nistudjaw is-separazzjoni tal-fażi u l-imġieba fid-dettall.LSPT αS fil-preżenza ta 'polikatazzjonijiet każwali f'ambjent ikkontrollat ​​f'konċentrazzjonijiet mikromolar baxxi u kundizzjonijiet fiżjoloġikament rilevanti (innota li l-konċentrazzjoni fiżjoloġika kkalkulata ta' αS hija > 1 µM50), wara imġieba tipika mmexxija termodinamikament ta 'LPS.Sibna li αS, li fih reġjun C-terminal iċċarġjat b'mod negattiv ħafna f'pH fiżjoloġiku, huwa kapaċi jifforma qtar b'ħafna proteini f'soluzzjoni milwiema permezz ta 'LLPS fil-preżenza ta' peptidi diżordinati katjoniċi ħafna bħal pLK jew Tau permezz tal-proċess ta 'elettrostatiku. kondensazzjoni kumplessa fil-preżenza ta 'makromolekuli ta' aggregazzjoni.Dan il-proċess jista 'jkollu effetti rilevanti fl-ambjent ċellulari fejn αS jiltaqa' ma 'diversi molekuli polikatjoniċi assoċjati mal-aggregazzjoni assoċjata mal-mard tiegħu kemm in vitro kif ukoll in vivo51,52,53,54.
F'ħafna studji, id-dinamika tal-proteini fi ħdan il-qtar tqieset bħala wieħed mill-fatturi ewlenin li jiddeterminaw il-proċess ta 'maturazzjoni55,56.F'koacervati elettrostatiċi ta 'αS b'polycations, il-proċess ta' maturazzjoni apparentement jiddependi fuq is-saħħa ta 'interazzjonijiet ma' polycations, il-valenza, u l-multipliċità ta 'dawn l-interazzjonijiet.It-teorija tal-ekwilibriju tissuġġerixxi li pajsaġġ ta 'ekwilibriju ta' żewġ stati likwidi jkun il-preżenza ta 'qtar kbir rikka f'bijopolimeri li jmexxu LLPS57,58.It-tkabbir tal-qtar jista 'jinkiseb bil-maturazzjoni Ostwald59, il-koalescence60 jew il-konsum ta' monomeru ħieles fil-fażi mxerrda61.Għal αS u Tau441, ΔNt-Tau jew pLK, ħafna mill-proteina kienet ikkonċentrata fil-kondensat taħt il-kundizzjonijiet użati f'dan l-istudju.Madankollu, filwaqt li qtar tau ta 'daqs sħiħ ngħaqad malajr mat-tixrib tal-wiċċ, il-koalescence u t-tixrib tal-qtar kienu diffiċli għal ΔNt-Tau u pLK, li jissuġġerixxi telf rapidu ta' proprjetajiet likwidi f'dawn iż-żewġ sistemi.Skont l-analiżi FLIM-FRET tagħna, il-qtar pLK u ΔNt-Tau ta 'età wrew grad simili ta' aggregazzjoni ta 'proteini (ħajja ta' fluworexxenza simili) bħall-qtar oriġinali, li jissuġġerixxi li n-netwerk oriġinali tal-proteini inżamm, għalkemm aktar riġidu.
Aħna nirrazzjonalizzaw ir-riżultati sperimentali tagħna fil-mudell li ġej (Figura 8).Il-qtar iffurmati inizjalment temporanjament huma ħafna drabi netwerks ta 'proteini mingħajr kumpens elettrostatiku, u għalhekk hemm żoni ta' żbilanċ ta 'ċarġ, speċjalment fl-interface tal-qtar, li jirriżulta fi qtar b'potenzjal għoli ta' wiċċ elettrostatiku.Biex tikkumpensa għall-ħlas (fenomenu komunement imsejjaħ it-tnaqqis tal-valenza) u jimminimizzaw il-potenzjal tal-wiċċ tal-qtar, il-qtar jistgħu jinkludu polipeptidi ġodda mill-fażi dilwita, jorganizzaw mill-ġdid in-netwerks tal-proteini biex jottimizzaw l-interazzjonijiet ta 'ċarġ-ċarġ, u jinteraġixxu ma' qtar ieħor.bl-uċuħ (tixrib).Il-qtar αS/pLK, minħabba n-netwerk tal-proteini aktar sempliċi tagħhom (interazzjonijiet eterotipiċi biss bejn αS u pLK) u affinità akbar għall-interazzjonijiet proteina-proteina, jidhru li jistgħu jibbilanċjaw il-ħlas tal-kondensat aktar malajr;tabilħaqq, osservajna kinetiċi tal-proteini aktar mgħaġġla f'koacervati αS/pLK iffurmati inizjalment milli f'αS/Tau.Wara t-tnaqqis tal-valenza, l-interazzjonijiet isiru inqas effimeri u l-qtar jitilfu l-proprjetajiet likwidi tagħhom u jinbidlu fi qtar simili ta 'ġel, li ma jaqbdux b'potenzjal baxx ta' wiċċ elettrostatiku (u għalhekk ma jistgħux ixarrbu l-wiċċ).B'kuntrast, qtar αS / Tau huma inqas effiċjenti fl-ottimizzazzjoni tal-bilanċ ta 'ċarġ tal-qtar minħabba netwerks ta' proteini aktar kumplessi (b'interazzjonijiet kemm omotipiċi kif ukoll eterotipiċi) u n-natura aktar dgħajfa tal-interazzjonijiet tal-proteini.Dan jirriżulta fi qtar li jżommu l-imġieba likwida għal perjodi estiżi ta 'żmien u juru potenzjal għoli tal-wiċċ elettrostatiku li għandu tendenza li jiġi minimizzat billi jingħaqad u jikber (b'hekk jimminimizza l-proporzjon tal-erja tal-wiċċ/volum tal-qtar) u billi jixxarrab il-kimika idrofilika tal-wiċċ.Dan joħloq libreriji kbar ta 'proteini kkonċentrati li jżommu proprjetajiet fluwidi peress li l-interazzjonijiet jibqgħu temporanji ħafna minħabba t-tfittxija kostanti għall-ottimizzazzjoni tal-ħlas fin-netwerk tal-proteini.Interessanti, forom maqtugħin N-terminalment ta 'Tau, inklużi xi isoforms62 li jseħħu b'mod naturali, juru imġieba intermedja, b'xi coacervates li qed jixjieħu b'αS fi qtar ta' ħajja twila bħal ġel, filwaqt li oħrajn jittrasformaw f'kondensati likwidi kbar.Din id-duwalità fil-maturazzjoni tal-koaċervati elettrostatiċi αS hija konsistenti ma 'studji teoretiċi u sperimentali reċenti tal-LLPS li identifikaw korrelazzjoni bejn it-tnaqqis tal-valenza u l-għarbil elettrostatiku f'kondensati bħala ċavetta għall-kontroll tad-daqs tal-kondensat u l-proprjetajiet tal-fluwidu.Mekkaniżmu 58.61.
Din l-iskema turi l-passaġġ putattiv ta 'aggregazzjoni tal-amilojde għal αS u Tau441 permezz ta' LLPS u LSPT.B'reġjuni addizzjonali sinjuri fl-anjoni (aħmar) u b'ħafna katjoni (blu), αS u tau koacervati elettrostatiċi b'valenza sodisfaċenti għandhom enerġija tal-wiċċ aktar baxxa u għalhekk inqas coalescence, li tirriżulta fit-tixjiħ rapidu tal-qtar.Jinkiseb stat ta 'ġell mhux agglomerat stabbli..Din is-sitwazzjoni hija favorevoli ħafna fil-każ tas-sistema αS/pLK minħabba l-affinità ogħla tagħha u n-netwerk ta 'interazzjoni ta' par ta 'proteini aktar sempliċi, li jippermetti tranżizzjoni mgħaġġla bħal ġel.Għall-kuntrarju, qtar b'valenza mhux sodisfaċenti u, għalhekk, reġjuni ċċarġjati bil-proteini disponibbli għall-interazzjoni, jagħmluha eħfef għall-coacervate li jingħaqad u jixxarrab il-wiċċ idrofiliku sabiex titnaqqas l-enerġija għolja tal-wiċċ tiegħu.Din is-sitwazzjoni hija preferibbli għal koaċervati αS/Tau441, li għandhom netwerk kumpless multivalenti li jikkonsisti f'interazzjonijiet dgħajfa Tau-Tau u αS-Tau.Min-naħa tagħhom, koaċervati akbar se jżommu aktar faċilment il-proprjetajiet tagħhom bħal fluwidu, li jippermettu li jseħħu interazzjonijiet oħra bejn proteini u proteini.Eventwalment, aggregati eteroġenji amilojdi li fihom kemm αS kif ukoll tau jiffurmaw fi ħdan il-fluwidu coacervate, li jistgħu jkunu relatati ma 'dawk misjuba f'korpi ta' inklużjoni, li huma karatteristiċi ta 'mard newrodeġenerattiv.
L-istrutturi kbar li jixbħu l-fluwidu ffurmati waqt il-maturazzjoni ta 'αS/Tau441 b'ambjent ta' proteina ikkonġestjonat ħafna iżda dinamiku u, sa ċertu punt, il-koaċervati αS/ΔNt-Tau huma ġibjuni ideali għan-nukleazzjoni tal-aggregazzjoni tal-proteini.Tabilħaqq osservajna l-formazzjoni ta 'aggregati ta' proteini solidi f'dan it-tip ta 'koaċervati ta' proteini, li ħafna drabi jkun fihom kemm αS kif ukoll tau.Aħna wrejna li dawn l-eteroaggregati huma stabbilizzati b'interazzjonijiet mhux elettrostatiċi, huma kapaċi jorbtu żebgħa ThT speċifiċi għall-amilojde bl-istess mod bħall-fibrili amilojdi tipiċi, u tabilħaqq għandhom reżistenza simili għal diversi influwenzi.L-aggregati αS/tau ffurmati minn LLPS intwerew li għandhom proprjetajiet bħal amilojdi.Tabilħaqq, il-varjant matur ta 'Tau defiċjenti fl-aggregazzjoni tal-amilojde huwa indebolit b'mod sinifikanti fil-formazzjoni ta' dawn l-aggregati eteroġenji αS fi ħdan il-koaċervat elettrostatiku likwidu.Il-formazzjoni ta 'aggregati αS/Tau441 kienet osservata biss ġewwa l-coacervates, li żammew proprjetajiet li jixbħu likwidu, u qatt, jekk il-coacervates/qtar ma laħqux l-istat tal-ġel.Fil-każ tal-aħħar, is-saħħa miżjuda tal-interazzjonijiet elettrostatiċi u, bħala riżultat, ir-riġidità tan-netwerk tal-proteini jipprevjenu r-riarranġamenti ta 'konformazzjoni meħtieġa ta' proteini biex jistabbilixxu interazzjonijiet ġodda ta 'proteini meħtieġa għan-nukleazzjoni tal-amilojde.Madankollu, dan jista 'jinkiseb f'koaċervati aktar flessibbli, li jixbħu likwidi, li min-naħa tagħhom huma aktar probabbli li jibqgħu likwidi hekk kif jiżdiedu fid-daqs.
Il-fatt li l-formazzjoni ta 'aggregati fi ħdan il-fażi kkondensata hija preferibbli f'kondensati αS/Tau kbar milli fi qtar żgħar li jiġel malajr, jenfasizza r-rilevanza li jiġu identifikati l-fatturi li jikkontrollaw il-koalescence tal-qtar.Għalhekk, mhux biss hemm tendenza għas-separazzjoni tal-fażijiet, iżda d-daqs tal-kondensat għandu jiġi kkontrollat ​​għal funzjonament tajjeb kif ukoll għall-prevenzjoni tal-mard58,61.Ir-riżultati tagħna jenfasizzaw ukoll l-importanza tal-bilanċ bejn LLPS u LSPT għas-sistema αS/Tau.Filwaqt li l-formazzjoni tal-qtar tista 'tipproteġi kontra l-aggregazzjoni tal-amilojde billi tnaqqas l-ammont ta' monomeri tal-proteini disponibbli taħt kundizzjonijiet ta 'saturazzjoni, kif ġie propost f'sistemi oħra63,64, il-fużjoni tal-qtar f'livelli għoljin ta' qtar tista 'twassal għal aggregazzjoni interna ta' proteina permezz ta 'riarranġamenti ta' konformazzjoni bil-mod.netwerks tal-proteini..
B'mod ġenerali, id-dejta tagħna tenfasizza bil-qawwa r-rilevanza tal-valenza koeżiva u l-interazzjonijiet sodisfatti/mhux sodisfatti fin-netwerks tal-waqgħa fil-kuntest tal-LSPT.B'mod partikolari, aħna nuru li l-kondensati αS/Tau441 ta' tul sħiħ huma kapaċi li jingħaqdu u jinnukleaw b'mod effiċjenti biex jiffurmaw eteroaggregati bħal amilojdi li jinkludu ż-żewġ proteini u jipproponu mekkaniżmu molekulari bbażat fuq ir-riżultati sperimentali tagħna.Il-ko-aggregazzjoni ta’ żewġ proteini fil-koaċervat tal-fluwidu αS/Tau li nirrapportaw hawn tista’ tabilħaqq tkun relatata mal-ko-lokalizzazzjoni ta’ żewġ proteini f’inklużjonijiet, li huma l-karatteristiċi tal-marda, u tista’ tikkontribwixxi għall-fehim tar-relazzjoni bejn LLPS u aggregazzjoni tal-amilojde, li twitti t-triq għal IDP iċċarġjat ħafna fin-newrodeġenerazzjoni.
WT-αS monomeriċi, mutanti cysteine ​​(Q24C-αS, N122C-αS) u varjanti ΔCt-αS (Δ101-140) ġew espressi f'E. coli u purifikati kif deskritt qabel.5 mM DTT ġie inkluż fil-passi kollha fil-purifikazzjoni ta 'mutanti αS cysteine ​​biex jipprevjenu l-formazzjoni ta' bonds disulfide.Isoforma Tau441 (plasmid miksub minn Addgene #16316), varjant ΔNt-Tau (Δ1-150, miksub permezz tal-klonazzjoni IVA bi primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) u AggDef-Tau varjant purifikat – kultura (ΔGC, ΔGC coli varjant) (ΔGC, ΔGC 77) varjant. kibret għal OD600 = 0.6-0.7 f'37 ° C u 180 rpm, u l-espressjoni ġiet indotta b'IPTG għal 3 sigħat f'37 ° C.Ħsad ċelluli f'11,500 xg għal 15 min f'4 °C u aħsel b'buffer salina li jkun fih 150 mM NaCl.Isospendi mill-ġdid il-pellet f'liżi buffer (20 ml għal kull 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin μM100).Il-pass tal-ivvibrar sar fuq is-silġ b'amplitudni ta '80% għal 10 impulsi (1 min mixgħul, 1 min mitfi).Taqbiżx 60 ml f'ultrasound wieħed.E. coli lysates ġew imsaħħna f'95 ° C għal 20 minuta, imbagħad imkessaħ fuq is-silġ u ċentrifugati f'127,000 × g għal 40 minuta.Is-supernatant ċċarat ġie applikat għal membrana ta’ 3.5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) u djalizzat kontra 4 L ta’ buffer tad-dijalisi (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 mM) għal 10 sigħat.Kolonna ta 'skambju ta' katjoni ta '5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ġiet ekwilibrata b'buffer ta' ekwilibrazzjoni (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).It-tau lysate ġie ffiltrat permezz ta 'filtru PVDF ta' 0.22 μm u injettat fil-kolonna b'rata ta 'fluss ta' 1 ml/min.L-elużjoni twettqet gradwalment, tau ġie eluwit b'buffer ta 'eluzzjoni 15-30% (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Il-frazzjonijiet ġew analizzati b'SDS-PAGE, u kwalunkwe frazzjoni li kien fiha faxxa waħda bil-piż molekulari mistenni ta' tau ġew ikkonċentrati bl-użu ta' filtru ċentrifugu ta' 10 kDa u sostitwiti b'buffer li fih 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM u DTT 2 mM għal il-konċentrazzjoni finali tal-proteina kienet 100 μM.Is-soluzzjoni tal-proteina mbagħad għaddiet minn filtru PVDF ta '0.22 μm, iffriżat malajr u maħżun f'-80 ° C.Il-proteina K18 ġentilment ġiet ipprovduta mill-Prof Alberto Boffi.Il-purità tal-preparazzjoni kienet> 95% kif ikkonfermat minn SDS-PAGE u MALDI-TOF/TOF.Diversi cysteines ġew ttikkettjati kimikament b'AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) jew TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).kienu kkonfermati mill-assorbiment u MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau u K18 ġew ittikkettati b'residwi nattivi ta 'cysteine ​​f'pożizzjonijiet 191 u 322 bl-użu ta' Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, il-Ġermanja) wara l-istess proċedura.Ħlas nett għal kull residwu mapep għal αS u Tau441 ġew iġġenerati bl-użu ta 'CIDER66.
Poly-L-lysine solidu (pLK DP 90-110 skond NMR mill-fornitur, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ġie maħlul f'10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 sa 10 mM konċentrazzjoni, proċess ivvibrat għal 5 minuti f'banju bl-ilma ultrasoniku u aħżen f'-20 ° C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) u FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) huma solubbli fl-ilma u mqassma b'mod wiesa 'f'LLPS buffer.Id-dijalisi tneħħi l-melħ li jikkontamina.Imbagħad ġew iffiltrati permezz ta 'filtru tas-siringa b'daqs tal-pori ta' 0.22 μm, u l-konċentrazzjonijiet tagħhom ġew ikkalkulati permezz ta 'refrattometru (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Kampjuni LLPS ġew ippreparati f'temperatura tal-kamra fl-ordni li ġejja: buffer u estrużjoni tħalltu u 1 mM tris(2-carboxyethyl)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) aċidu tetraacetic (EDTA, carboxynth) u taħlita ta '1% inibitur tal-protease (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Imbagħad αS u polycations fused (għażliet pLK jew Tau) huma miżjuda.Għal esperimenti ta 'serje ta' ħin ta 'thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), uża l-konċentrazzjoni totali ta' ThT biex tkun nofs il-konċentrazzjoni αS.Ħallat il-kampjuni bil-mod iżda bir-reqqa biex tiżgura li jkunu omoġenji.Il-konċentrazzjoni ta 'kull komponent varjat minn esperiment għal esperiment, kif deskritt fit-taqsima Riżultati.Azide intuża f'konċentrazzjoni ta '0.02% (w/v) kull meta t-tul tal-esperiment qabeż l-4 sigħat.Għall-analiżi kollha bl-użu ta' kampjuni LLPS, ħalli t-taħlita tibbilanċja għal 5 minuti qabel l-analiżi.Għall-analiżi tat-tifrix tad-dawl, 150 µl ta’ kampjuni ġew mgħobbija fuq mikropjanċi 96-well li ma jorbtux (µClear®, iswed, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, l-Awstrija) u miksija b’film adeżiv.LLPs ġew immonitorjati billi titkejjel l-assorbiment f'350 nm fiċ-ċentru tas-soluzzjoni f'qarrej tal-pjanċa CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, il-Ġermanja).L-esperimenti twettqu fi tliet kopji f'25 ° C, u l-iżbalji ġew ikkalkulati bħala d-devjazzjoni standard mill-medja.Il-fażi dilwita ġiet ikkwantifikata permezz ta 'ċentrifugazzjoni tal-kampjun u analiżi tal-ġel SDS-PAGE, u l-frazzjoni αS fil-fażijiet dilwiti u konċentrati ġiet kwantifikata f'diversi soluzzjonijiet LLPS.Kampjun ta '100 μl LLPS li fih αS ittikkettat 1 μM AF488 ġie ppreparat permezz ta' taħlit bir-reqqa segwit minn ċentrifugazzjoni f'9600 × g għal 30 minuta, wara li l-preċipitat kien ġeneralment viżibbli.L-ogħla 50 μl tas-supernatant intużaw għall-kwantifikazzjoni tal-proteini bl-użu ta 'ġel SDS-PAGE.Ġellijiet ġew skennjati b'filtri AF488 bl-użu ta 'sistema ta' immaġini tal-ġel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) jew imtebba 'b'tebgħa Coomassie u viżwalizzati b'filtri xierqa.Il-meded li rriżultaw ġew analizzati bl-użu ta 'ImageJ verżjoni 1.53i (Istituti Nazzjonali tas-Saħħa, USA).L-esperimenti twettqu f'żewġ esperimenti differenti b'riżultati simili.
Tipikament, 150 μl ta 'kampjuni ġew applikati għal mikropjanċi 96-well li ma jorbtux u viżwalizzati f'temperatura tal-kamra fuq mikroskopju invertit Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, il-Ġermanja).Għal esperimenti fuq il-post, intużaw ukoll pjanċi µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, il-Ġermanja) jew mikropjanċi tal-polistirene 96-well (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Lampi tal-aloġenu EL6000 jew tal-merkurju tal-alid tal-metall intużaw bħala sorsi ta 'illuminazzjoni (għall-immaġini BF/DIC u WF, rispettivament).Għall-mikroskopija WF, intuża objettiv ta 'l-arja ta' ingrandiment ta '40x (Leica Microsystems, il-Ġermanja) biex jiffoka d-dawl fuq il-kampjun u jinġabar.Għal kampjuni bit-tikketta AF488 u ThT, iffiltra eċċitazzjoni u emissjoni b'settijiet ta 'filtri GFP standard, filtri bandpass ta' eċċitazzjoni u emissjoni, rispettivament, filtri bandpass 460-500 nm u 512-542 nm, u mera dikrojka ta '495 nm.Għal kampjuni ttikkettjati b'Atto647N, intużaw sett standard ta 'filtri Cy5 b'filtri bandpass ta' eċċitazzjoni u emissjoni 628-40 nm u 692-40 nm, rispettivament, u mera dikroika ta '660 nm.Għall-mikroskopija BF u DIC, uża l-istess għan tal-ġbir tad-dawl rifless.Id-dawl miġbur ġie rreġistrat fuq kamera Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, il-Ġermanja).Il-ħin ta' espożizzjoni kien ta' 50 ms għall-immaġni tal-mikroskopija BF u DIC u 20-100 ms għall-immaġini tal-mikroskopija WF.Għal tqabbil, il-ħin ta 'espożizzjoni għall-esperimenti kollha b'ThT kien 100 ms.Twettqu esperimenti ta 'time-lapse biex jivviżwalizzaw il-koalescence tal-qtar, bl-immaġini jinġabru kull 100 ms għal diversi minuti.ImageJ (NIH, USA) intużat għall-analiżi tal-immaġni.L-esperimenti twettqu fi tliet kopji b'riżultati simili.
Għal esperimenti ta 'kololizzazzjoni, FRAP u rikostruzzjoni 3D, immaġini ġew akkwistati fuq mikroskopju konfokali invertit Zeiss LSM 880 bl-użu ta' edizzjoni blu ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, il-Ġermanja).Kampjuni ta' 50 µl ġew applikati għal µ-Slide Angiogenesis Petri dishes (Ibidi GmbH, Gröfelfing, il-Ġermanja), ittrattati b'polimeru idrofiliku (ibiTreat) u mmuntati f'objettiv ta' immersjoni taż-żejt 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) fuq DIC).L-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta’ linji tal-laser argon ta’ 458 nm, 488 nm u 633 nm b’riżoluzzjoni ta’ 0.26 µm/pixel u ħin ta’ espożizzjoni ta’ 8 µs/pixel għal twieqi ta’ skoperta ta’ eċitazzjoni u emissjoni ta’ 470–600 nm, 493–628 nm, u 638-755 nm intuża biex jivviżwalizza ThT, AF488 u Atto647N, rispettivament.Għall-esperimenti FRAP, fotografija time-lapse ta 'kull kampjun ġiet irreġistrata f'qafas 1 kull sekonda.L-esperimenti twettqu fi tliet kopji f'temperatura tal-kamra b'riżultati simili.L-immaġini kollha ġew analizzati bl-użu ta 'softwer tal-edizzjoni blu Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, il-Ġermanja).Il-kurvi tal-FRAP ġew normalizzati, ippjanati u mwaħħla mad-dejta tal-intensità/ħin estratta minn immaġini bl-użu ta 'Zen 2 bl-użu ta' OriginPro 9.1.Il-kurvi ta 'rkupru ġew imwaħħla ma' mudell mono-esponenzjali biex jagħtu kont għad-diffużjoni molekulari b'terminu esponenzjali addizzjonali biex jagħti kont għall-effett tal-ibbliċjar tal-akkwist.Imbagħad ikkalkulajna D bl-użu tar-raġġ nominali tal-ibbliċjar u l-half-life ta 'rkupru ddeterminat qabel bħal fl-ekwazzjoni ta' Kang et al.5 35 murija.
Varjanti ta' cysteine ​​waħedhom ta' αS ġew sintetizzati b'4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) f'pożizzjonijiet 24 (TEMPOL-24-αS) u 122 (TEMPOL-122-αS), rispettivament.Spin Labeling Għal esperimenti EPR, il-konċentrazzjoni αS ġiet issettjata għal 100 μM u l-konċentrazzjoni PEG kienet 15% (w/v).Għal diversi kundizzjonijiet ta 'aggregazzjoni, il-proporzjon αS:pLK kien 1:10, filwaqt li l-proporzjonijiet αS:ΔNt-Tau u αS:Tau441 inżammu f'1:1.Għal esperimenti ta 'titrazzjoni li jorbtu fin-nuqqas ta' iffullar, TEMPOL-122-αS inżamm f'50 μM u polycations ġew ttitrati f'konċentrazzjonijiet dejjem jiżdiedu, u ppreparaw kull kundizzjoni separatament.Il-kejl CW-EPR twettaq bl-użu ta 'spettrometru tal-medda X Bruker ELEXSYS E580 mgħammar b'resonatur Bruker ER4118 SPT-N1 li jaħdem bi frekwenza microwave (SHF) ta' ~ 9.7 GHz.It-temperatura ġiet issettjata għal 25 ° C u kkontrollata minn kriostat tan-nitroġenu likwidu.L-ispettri nkisbu taħt kundizzjonijiet mhux saturati b'qawwa MW ta '4 mW, amplitudni ta' modulazzjoni ta '0.1 mT, u frekwenza ta' modulazzjoni ta '100 kHz.Intensitajiet spettrali ġew normalizzati biex jiġu evitati differenzi fil-konċentrazzjonijiet ta 'spin bejn il-kampjuni u tnaqqis possibbli ta' spin minħabba konċentrazzjonijiet residwi ta 'aġenti li jnaqqsu f'kampjuni li fihom Tau441 jew ΔNt-Tau (preżenti fis-soluzzjonijiet oriġinali tal-proteini).Il-valuri mogħtija ta 'g inkisbu bħala riżultat ta' mudellar spettrali EPR imwettaq bl-użu tas-softwer Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) implimentat f'Matlab®67.Intużaw mudelli iżotropiċi ta' komponent wieħed/żewġ biex jimmudellaw id-dejta.Wara n-normalizzazzjoni tas-sinjali kollha, ir-residwi ġew ikkalkulati billi titnaqqas kull simulazzjoni mill-ispettru sperimentali korrispondenti.Għall-analiżi tat-titrazzjoni li torbot, l-intensità relattiva tat-tielet faxxa għat-tieni faxxa tal-ispettru EPR normalizzat (IIII/III) intużat biex timmonitorja l-irbit tal-polikatazzjonijiet ma 'αS.Biex tiġi stmata l-kostanti tad-dissoċjazzjoni (Kd), il-kurva li tirriżulta twaħħlet ma 'mudell approssimattiv li jassumi n siti ta' rbit identiċi u indipendenti.
L-esperimenti ta' spettroskopija NMR twettqu bl-użu ta' spettrometru NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) mgħammar bi krijoprobe u Z-gradient.L-esperimenti kollha twettqu bl-użu ta '130-207 µM αS u ekwivalenti αS/ΔNt-Tau u pLK korrispondenti f'10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 u saru f'15 ° C.Biex timmonitorja l-LPS bl-NMR, 10% PEG ġie miżjud mal-kampjuni mħallta minn qabel.Il-plot tal-perturbazzjoni tal-bidla kimika (Fig. 1b) turi l-bidliet kimiċi medji 1H u 15N.L-ispettri αS 2D1H-15N HSQC ġew assenjati abbażi ta' assenjazzjoni preċedenti (entrata BMRB #25227) u kkonfermati bir-reġistrazzjoni u l-analiżi tal-ispettri 3D ta 'HNCA, HNCO u CBCAcoNH.Ċaqliq kimiċi 13Cα u 13Cβ ġew ikkalkulati fil-preżenza ta 'ΔNt-Tau jew pLK biex jitkejlu bidliet possibbli fix-xejriet ta' l-istruttura sekondarja meta mqabbla ma 'bidliet kimiċi αS f'konformazzjoni ta' coil każwali pura 68 (Figura Supplimentari 5c).Ir-rati R1ρ tkejlu billi jiġu rrekordjati esperimenti hsqctretf3gpsi (miksbu mil-librerija Bruker) b'dewmien ta '8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, u 800 ms, u l-funzjonijiet esponenzjali ġew aġġustati għad-dewmien tal-ogħla intensità differenti. darbiet biex jiddetermina l-R1ρ u l-inċertezza sperimentali tiegħu.
Twettqu esperimenti b'żewġ kuluri ta 'mikroskopija ta' fluworexxenza riżolta fil-ħin fuq mikroskopju konfokali ta 'fluworexxenza MT200 kummerċjali riżolt fil-ħin (PicoQuant, Berlin, il-Ġermanja) b'apparat ta' għadd ta 'foton wieħed korrelat mal-ħin (TCSPC).Ir-ras tad-dijodu tal-lejżer tintuża għal eċitazzjoni interleaved pulsata (PIE), ir-raġġ jgħaddi minn gwida tal-mewġ tal-modalità waħda u huwa rregolat għal qawwa tal-lejżer ta '10 sa 100 nW għal linji tal-laser 481 nm u 637 nm imkejla wara mera dikroika.Dan jiżgura rata ottimali tal-għadd tal-fotoni, li tevita l-effetti tal-aliasing tal-fotoni, photobleaching u saturazzjoni.Coverslips jew pjanċi tal-anġjoġenesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, il-Ġermanja) tqiegħdu direttament f'ilma ta 'immersjoni fuq lenti Super Apochromat 60x NA 1.2 b'għonq korrettiv (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Mera dikroika 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) intużat bħala s-divider tar-raġġ prinċipali.Ir-radjazzjoni mhux iffukata hija mblukkata minn toqba b'dijametru ta '50 mikron, allura r-radjazzjoni ffukata hija maqsuma f'2 mogħdijiet ta' skoperta bi splitter tar-raġġ 50/50.Filtri ta 'emissjoni ta' bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 għal żebgħa ħadra (AF488) u 690/70 għal żebgħa ħamra (Atto647N) intużaw quddiem id-ditekter.Diodes tal-valanga b'foton wieħed (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, l-Italja) intużaw bħala ditekters.Kemm il-ġbir tad-dejta kif ukoll l-analiżi saru bl-użu tas-softwer SymphoTime64 disponibbli kummerċjalment (PicoQuant GmbH, Berlin, il-Ġermanja).
Ħamsin mikrolitru ta 'kampjuni LLPS ġew applikati għal bjar ta' anġjoġenesi μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, il-Ġermanja).L-immaġini li jirriżultaw huma ffukati sa 20 µm 'il fuq mill-qiegħ tal-bir għal distanza ta' ħidma oġġettiva ottimali għal qtar sospiżi u għal ~ 1 µm għal ċattri u tikek b'riżoluzzjoni axjali ta 'mill-inqas 0.25 µm/pixel u ħin ta' dewmien ta '400 µs/pixel.Agħżel id-dejta billi tapplika limitu ta 'intensità bbażat fuq l-intensità medja tas-sinjal fl-isfond (PBG, medja + 2σ) għal kull kanal sabiex jintgħażlu biss qtar ta' proteina likwida, ċattri, jew spots, billi tiffiltra kull oriġini possibbli mill-fażi mxerrda.Biex tanalizza l-ħajja ta’ kull speċi (τ) ta’ kull kanal (aħdar, “g” għal AF488 u aħmar, “r” għal Atto647N), għażilna reġjuni ta’ interess (ROIs) li fihom qtar, ċattri, jew tikek (Figura 1 Supplimentari ).8b) u dderivawhom billi twaħħlu t-tħassir tul il-ħajja tagħhom (τD, τR u τP għal qtar, ċattri jew spots, rispettivament, ara Fig. 8c Supplimentari) f'kull kanal bl-użu ta 'analiżi tat-tail-fit u mudell ta' tħassir b'żewġ komponenti.Medja τ minn τ .ROIs li pproduċew ftit wisq fotoni għal adattament multi-esponenzjali ġew esklużi mill-analiżi.Il-cutoff użat kien <104 fotoni għal ċattri u tikek u 103 għal qtar.Il-qtar għandhom limitu aktar baxx minħabba li huwa diffiċli li jinkisbu kurvi ta 'tħassir b'valuri ta' intensità ogħla, peress li l-qtar fil-qasam tal-immaġni huma ġeneralment iżgħar u inqas numerużi.ROIs b'għadd ta' fotoni 'l fuq mil-limitu ta' akkumulazzjoni ta 'fotoni (sett għal> 500 għadd/pixel) ġew skartati wkoll għall-analiżi.Qabbel il-kurva tat-tħassir tal-intensità miksuba mir-reġjun ta 'interess b'intensità f'90% tal-massimu (ftit wara l-intensità massima tat-tħassir) mill-bidu tal-ħajja tas-servizz biex tiżgura interferenza minima tal-IRF filwaqt li żżomm l-istess għat-tħassir tal-intensità kollha settings Tieqa tal-ħin relattiv Ġew analizzati 25 sa 50 ROI għal ċattri u spots u 15-25 ROI għal qtar, immaġini magħżula minn aktar minn 4 repliki rreġistrati minn mill-inqas 3 esperimenti indipendenti.Intużaw it-testijiet b'żewġ denbu biex jevalwaw id-differenzi statistiċi bejn l-ispeċi jew bejn is-sistemi ta' coacervate.Għal analiżi pixel b'pixel tal-ħajja (τ), ġiet ikkalkulata l-attenwazzjoni totali tal-ħajja fuq il-qasam għal kull kanal u twettqet approssimazzjoni ta 'mudell ta' attenwazzjoni esponenzjali ta '2/3-komponent.L-attenwazzjoni tul il-ħajja għal kull pixel mbagħad twaħħlet bl-użu ta 'valuri τ ikkalkulati qabel, li rriżultaw f'immaġni FLIM fit pseudocolor.Il-medda tal-ħajja tat-twaħħil tad-denb kienet l-istess fl-immaġini kollha tal-istess kanal, u kull tħassir ipproduċa biżżejjed fotoni biex jipprovdi aġġustament affidabbli.Għall-analiżi FRET, il-pixels intgħażlu bl-applikazzjoni ta 'limitu ta' intensità aktar baxxa ta '100 fotoni, li kellu medja ta' sinjal fl-isfond (FBG) ta '11-il fotoni.L-intensità tal-fluworexxenza ta 'kull kanal ġiet ikkoreġuta b'fatturi ta' korrezzjoni determinati b'mod sperimentali: 69 crosstalk spettrali α kien 0.004, eċċitazzjoni diretta β kienet 0.0305, effiċjenza ta 'skoperta γ kienet 0.517.L-effiċjenza FRET fil-livell tal-pixel imbagħad tiġi kkalkulata bl-użu tal-ekwazzjoni li ġejja:
fejn FDD hija l-intensità tal-fluworexxenza osservata fil-kanal donatur (aħdar), l-FDA hija l-intensità tal-fluworexxenza osservata fil-kanal li jaċċetta (aħmar) taħt eċċitazzjoni indiretta, u FAA hija l-intensità tal-fluworexxenza osservata fil-kanal li jaċċetta (aħmar) taħt eċċitazzjoni diretta ( PIE).L-impulsi tal-intensità tal-fluworexxenza huma osservati fil-kanal).
Poġġi 100 µl ta’ soluzzjonijiet ta’ reazzjoni LLPS li fihom 25 µM ta’ Tau441 monomeriku mhux tikkettat (bi jew mingħajr 25 µM αS) f’LLPS buffer (supplimentat bħal hawn fuq) fuq mikropjanċi ta’ 96-well li ma jorbtux b’kisja ta’ fojl adeżiv u l-formazzjoni ta’ qtar ġiet iċċekkjata permezz ta’ mikroskopija WF. ekwilibrazzjoni.fi żmien 10 min.Wara 48 siegħa ta 'inkubazzjoni f'temperatura tal-kamra, il-preżenza ta' ċattri u spots tal-proteini ġiet ikkonfermata.Imbagħad neħħi bir-reqqa l-likwidu fuq iċ-ċattri mill-bjar, imbagħad żid 50 L ta 'buffer ta' dissoċjazzjoni (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) u inkuba għal 10 min.Il-konċentrazzjoni għolja tal-melħ tiżgura li LLPS mhux se jirrepeti minħabba PEG residwu, u assemblaġġi ta 'proteini possibbli ffurmati biss minn interazzjonijiet elettrostatiċi se jiġu żarmati.Il-qiegħ tal-bir imbagħad ġie mibrux bir-reqqa b'ponta tal-mikropipetta u s-soluzzjoni li tirriżulta ġiet trasferita għal bir ta 'osservazzjoni vojta.Wara l-inkubazzjoni tal-kampjuni b'50 μM ThT għal siegħa, il-preżenza ta 'tikek iżolati ġiet iċċekkjata bil-mikroskopija WF.Ipprepara fibri αS ivvibrati billi tinkuba 300 µl ta’ soluzzjoni αS 70-µM f’PBS b’pH 7.4, sodium azide 0.01% f’37 °C u 200 rpm fuq orbital shaker għal 7 ijiem.Is-soluzzjoni mbagħad ġiet ċentrifugata f'9600 × g għal 30 min, il-pellet ġie sospiż mill-ġdid f'PBS pH 7.4 u ivvibrat (1 min, ċiklu ta '50%, amplitudni ta' 80% f'vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) kampjuni tal-fibril b'distribuzzjoni tad-daqs relattivament uniformi ta 'fibrils żgħar.
Analiżi FCS/FCCS u sejbien ta 'koinċidenza b'żewġ kuluri (TCCD) saru fuq l-istess mikroskopju konfokali fluworexxenti riżolt fil-ħin MT200 (Pico-Quant, Berlin, Ġermanja) użat għall-esperimenti tal-mikroskopija FLIM-FRET bl-użu tal-mod PIE.Il-qawwa tal-lejżer għal dawn l-esperimenti ġiet miżjuda ma '6.0 µW (481 nm) u 6.2 µW (637 nm).Il-kombinazzjoni ta 'dawn is-setgħat tal-lejżer intgħażlet biex tipproduċi luminożità simili għall-pari ta' fluworofori użati filwaqt li jinkisbu rati ta 'għadd ottimali u jiġu evitati fotobliċ u saturazzjoni.Kemm il-ġbir tad-dejta kif ukoll l-analiżi twettqu bl-użu tas-softwer tal-verżjoni 2.3 SymphoTime64 disponibbli kummerċjalment (PicoQuant, Berlin, il-Ġermanja).
Kampjuni ta’ aggregati iżolati ta’ αS/Tau miksuba bl-użu ta’ LLPS huma dilwiti f’buffer ta’ iżolament sal-konċentrazzjoni monomolekulari xierqa (tipikament dilwizzjoni ta’ 1:500, peress li l-aggregati huma diġà f’konċentrazzjonijiet baxxi meta jkunu iżolati minn kampjuni ta’ coacervate).Il-kampjuni ġew applikati direttament għal coverslips (Corning, USA) miksija minn qabel b'soluzzjoni BSA f'konċentrazzjoni ta '1 mg/mL.
Għall-analiżi PIE-smFRET fil-kanali ħodor u ħomor, ġie applikat limitu ta 'intensità aktar baxxa ta' 25 fotoni biex jiġu ffiltrati sinjali ta 'intensità baxxa kkawżati minn avvenimenti monomeriċi (innota li l-monomeri jaqbżu l-kampjuni aggregati meta mqabbla ma' aggregati iżolati).Dan il-limitu ġie kkalkulat bħala ħames darbiet l-intensità medja ta 'αS monomeriku miksuba mill-analiżi ta' kampjuni ta 'monomeru pur sabiex jintgħażlu speċifikament l-aggregati għall-analiżi.Iċ-ċirkwit tas-sewqan PIE, flimkien mal-akkwist tad-dejta TSCPC, ippermetta l-applikazzjoni ta 'filtru tal-ippeżar tul il-ħajja li jgħin jelimina l-isfond u l-crosstalk spettrali.L-intensità tal-flare magħżula bl-użu tal-limiti ta 'hawn fuq ġiet ikkoreġuta bl-użu tas-sinjal medju tal-isfond determinat mill-istogrammi tal-okkorrenza kontra l-intensità/bin tal-kampjuni tal-buffer biss.Il-fqigħ assoċjati ma' aggregati kbar tipikament jokkupaw diversi bins konsekuttivi fit-traċċa tal-ħin (issettjat għal 1 ms).F'dawn il-każijiet, intgħażlet bin ta' saħħa massima.Għall-FRET u l-analiżi stojkjometrika, intuża l-fattur gamma γ (0.517) iddeterminat teoretikament.Crosstalk spettrali u kontribuzzjonijiet ta 'eċitazzjoni diretta huma negliġibbli (determinati b'mod sperimentali) fil-qawwa tal-lejżer ta' eċċitazzjoni użata.L-effiċjenza u l-istojkjometrija ta 'FRET fi splużjoni hija kkalkulata kif ġej.