Komponent kimiku ta' tubi koljati ta 'l-istainless steel 347, Identifikazzjoni ta' proteini chaperone ta 'antiġen-A tal-lewkoċiti umani ġodda li jirrispondu għall-interferon (HLA-A) bl-użu ta' spettrometrija tal-massa cross-linked (CLMS)

Grazzi talli żort Nature.com.Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Sliders li juru tliet artikoli għal kull slide.Uża l-buttuni ta 'wara u li jmiss biex timxi permezz tal-pjastri, jew il-buttuni tal-kontrollur tas-slajds fl-aħħar biex tiċċaqlaq minn kull slide.

Deskrizzjoni tal-prodott

Stainless Steel 347L Coil Tubi, Grad ta 'l-Azzar: SS347L

Is-sistema ta 'sinjalazzjoni ta' l-interferon tinduċi rispons qawwi ta 'ċitokini għal firxa wiesgħa ta' sinjali patoġeniċi u intrinsiċi patoloġiċi mill-ambjent, li tirriżulta fl-induzzjoni ta 'sottogruppi ta' proteini li jistgħu jinduċu l-interferon.Applikajna spettrometrija tal-massa cross-link medjata mid-DSS (CLMS) biex niskopru interazzjonijiet ġodda proteina-proteina fid-dominju tal-proteini indotti mill-interferon.Minbarra l-proteini mistennija li jinduċu l-interferon, identifikajna wkoll adducts cross-linked intermolekulari u intramolekulari ġodda ta 'proteini kanoniċi li jistgħu jinduċu l-interferon bħal MX1, USP18, OAS3 u STAT1.Aħna ffukajna fuq validazzjoni ortogonali ta 'sett ġdid ta' netwerks ta 'proteini li jinduċu l-interferon iffurmati minn proteini HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) bl-użu ta' ko-immunopreċipitazzjoni u l-istudju ulterjuri tagħhom bl-użu ta 'mudellar ta' dinamika molekulari.L-immudellar tad-dinamika konformazzjonali tal-kumpless tal-proteini żvela diversi siti ta 'interazzjoni li rriflettew l-interazzjonijiet identifikati fis-sejbiet tas-CLMS.Flimkien, aħna nippreżentaw studju pilota ta 'CLMS biex jidentifikaw kumplessi ta' sinjalazzjoni ġodda indotti minn interferon, u nistennew bil-ħerqa l-użu usa 'ta' CLMS biex tidentifika dinamika ġdida ta 'interazzjonijiet ta' proteini fil-mikroambjent tat-tumur.
Qabel ma jibda rispons immuni adattiv, is-sistema ta' difiża intrinsika ta' l-ospitant itella' rispons antimikrobiku medjat minn familja ta' ċitokini alfa-helical imnixxija msejħa interferoni (IFNs).Il-klassijiet IFN tat-tip I IFNα u IFNβ jattivaw risponsi ċellulari, inklużi stati antivirali, proapoptotiċi, proinfjammatorji u antiproliferattivi.Fil-bnedmin, huma magħrufa 13-il sottotip ta' IFNα, kollha miġbura fuq il-kromożoma 91. B'mod sorprendenti, IFNα2 biss ġie studjat għall-użu kliniku.Riċentement, ingħatat attenzjoni speċjali lir-riċerka dwar sottotipi oħra ta 'IFNα.Studju reċenti wera li IFNα14 hija waħda mill-iżoformi l-aktar effettivi biex tirrestrinġi r-replikazzjoni ta 'HBV2 u HIV-13,4 meta mqabbla mas-sottotip kanoniku IFNα2.
Ġie stabbilit li l-kumplessi attivati ​​tar-riċetturi tal-interferon tat-tip I (IFNAR1 u IFNAR2) jikkawżaw kaskata tat-trasduzzjoni tas-sinjali medjata minn Janus kinases TYK2 u JAK15,6.Dawn Janus kinases phosphorylate transducers tas-sinjal u attivaturi tal-proteini transcriptional (STAT1 u STAT2) fuq residwi ta 'tyrosine biex jibdew heterodimerization medjat mid-dominju SH26.Sussegwentement, IRF9 jorbot STAT eterodimeri biex jifforma kumpless trimeriku tal-ġene tal-fattur 3 stimulat bl-IFN (ISGF3), li jittrasloka għan-nukleu u jinduċi t-traskrizzjoni ta 'aktar minn 2000 ġene stimulat bl-interferon (ISGs)5,6,7,8.
L-ISGs jiffurmaw is-sinsla tas-sistema immuni intrinsika, speċjalment bi tweġiba għal attakk virali.Bħala l-ewwel linja ta 'difiża kontra l-infezzjoni virali, iċ-ċelloli jużaw malajr interazzjonijiet estensivi ta' proteini ċellulari b'firxa wiesgħa ta 'attivitajiet bijoloġiċi.Dawn il-proteini jinkludu riċetturi ta 'rikonoxximent tal-mudell, molekuli ta' sinjalazzjoni, fatturi ta 'traskrizzjoni, u proteini b'funzjonijiet antivirali diretti, kif ukoll regolaturi negattivi ta' risponsi immuni9.Ħafna mill-informazzjoni dwar l-attività ISG ġejja minn skrins funzjonali li jużaw skrins ta’ espressjoni eċċessiva10,11 jew tekniki ta’ sajlenser tal-ġeni (siRNA, RNAi u CRISPR)12,13 li fihom ISGs individwali huma espressi jew inibiti u l-attività tagħhom tiġi ttestjata fuq diversi viruses.Għalkemm dawn l-istudji ddeterminaw il-proprjetajiet antivirali ta 'ISGs individwali, il-mekkaniżmi molekulari sottostanti ta' kull ISG għadhom fil-biċċa l-kbira mhux magħrufa.Huwa ġeneralment aċċettat li ħafna proteini jinteraġixxu ma 'ċitokini waħda jew aktar biex jiżguraw attività sħiħa, għalhekk jew ISGs jinteraġixxu direttament jew l-interazzjonijiet tagħhom huma medjati minn proteini ċellulari.Pereżempju, studju reċenti tal-proteomika photocrosslinked identifika ATPase VCP/p97 bħala sieħeb maġġuri ta 'interazzjoni IFITM3, li l-inibizzjoni tiegħu twassal għal difetti fl-għażla liżosomali, turnover, u kotrasport ta' IFITM3 b'partiċelli virali 14 .Bl-użu ta 'immunopreċipitazzjoni, identifikajna VAPA, proteina assoċjata mal-vesikuli, bħala sieħeb ta' interazzjoni ma 'IFITM1/2/3 li timmedja l-maturazzjoni virali medjata mill-kolesterol, u dan ġie kkonfermat minn studju ieħor bl-użu ta' sistema b'żewġ ibridi tal-ħmira.Appoġġ Xjentifiku 15 , 16 .
Proċess bijoloġiku fundamentali involut fit-trażżin tal-infezzjoni u t-trasformazzjoni malinna huwa l-preżentazzjoni tal-antiġen, li hija medjata minn molekuli ta 'kumpless maġġuri tal-istokompatibilità (MHC).Peptidi (tul 8-12 aċidi amminiċi) minn proteini mqattgħin, terminati qabel iż-żmien jew mitwija ħażin huma mgħobbija fl-eterodimer MHC-I (li jikkonsisti minn ktajjen tqal u ħfief MHC-I, imsejħa β-2-microglobulin; β2M) 17,18.It-trimeri MHC-I stabbli li jirriżultaw huma ttrasportati lejn il-wiċċ taċ-ċellula, fejn jippreżentaw peptidi intraċellulari għal ċelluli T CD8+ (ċelluli T ċitotossiċi)17.Iċ-ċelloli T jagħrfu u jeqirdu dawn il-patoġeni u ċ-ċelloli li jġorru antiġen speċifiku għat-tumur.Konsegwentement, il-patoġeni u ċ-ċelloli tat-tumur ħafna drabi jrażżnu l-proċess tal-preżentazzjoni tal-antiġeni biex tiġi evitata s-sorveljanza immuni.Barra minn hekk, MHC-I huwa rregolat 'l isfel f'40-90% tat-tumuri tal-bniedem u ħafna drabi huwa assoċjat ma' pronjosi ifqar19.
Ġeni involuti fir-rispons għall-patoġeni għandhom jaqilbu malajr bejn stat ta 'mistrieħ u stat ta' traskrizzjoni attiva.Għalhekk, diversi proteini ċellulari huma ipoteżiti li jkunu involuti fir-rispons għal domanda għolja ta 'IFN fuq perjodi qosra ta' żmien, inkluż remodeling u modifika tal-promotur tal-kromatin 20,21.Ħafna studji ffukaw fuq l-identifikazzjoni ta 'sieħba individwali tal-proteini ISG fil-preżenza ta' IFN.Diversi studji proteomiċi u transcriptomic f'sistemi ta 'ċelluli mudell iċċaraw l-effett ta' IFN fuq il-pajsaġġ ċellulari.Madankollu, minkejja fehim dejjem jikber tad-dinamika indotta mill-interferons, għadna ftit nafu dwar l-involviment tal-ISGs.Meta wieħed iqis il-kumplessità u d-dinamika li tiddependi mill-ħin tas-sinjalar tal-interferon, iqumu żewġ mistoqsijiet: (i) huwa possibbli li jiġu stabbilizzati u maqbuda l-kumplessi multiproteini involuti fis-sinjalar mgħaġġel, u (ii) dawn l-interazzjonijiet jistgħu jiġu mmappjati fi spazju 3D?
Biex nindirizzaw dawn il-kwistjonijiet, implimentajna disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) flimkien ma 'spettrometrija tal-massa (CLMS) biex nistudjaw in-netwerk ta' interazzjoni tal-proteini indotti minn IFNα u d-dinamika tiegħu.DSS iżid rabtiet kovalenti bejn residwi prossimali ta 'proteini u/jew kumplessi ta' proteini in vivo.Analiżi MS sussegwenti tiżvela siti speċifiċi ta 'crosslinking li jirriflettu l-prossimità spazjali ta' reġjuni fi ħdan proteina partikolari, imsejħa rabtiet interni, jew subunitajiet f'kumplessi ta 'proteini, imsejħa interrelazzjonijiet.Bl-użu ta 'dan l-approċċ, identifikajna diversi kumplessi ġodda ta' proteina-proteina kif ukoll netwerks ta 'interazzjoni multiproteina indotti minn interferon.Billi nittestjaw aktar subsett ta 'dawn l-interazzjonijiet ġodda, aħna nuru li H2BFS (H2B histone-tip FS; minn hawn 'il quddiem imsejħa H2B) u MDN1 jaġixxu bħala msieħba li jorbtu għal HLA-A.
Iċ-ċelloli Flo-1 huma wieħed mill-mudelli in vitro l-aktar magħrufa ta 'adenokarċinoma esophageal peress li jimitaw karatteristiċi ewlenin ta' tumuri esophageal22,23.Madankollu, mhux it-tumuri kollha huma immunoġeniċi, u biex jiddeterminaw jekk iċ-ċelluli Flo-1 jirrispondux għat-trattament bl-interferon, aħna kkurajna ċ-ċelloli Flo-1 b'10 ng/ml IFNα għal 72 siegħa.Iċ-ċelloli Flo-1 wrew induzzjoni bikrija ta 'pSTAT1 u IRF1, li bdew sagħtejn wara t-trattament u komplew għal 72 siegħa, bi tnaqqis dipendenti fuq il-ħin fil-livelli stazzjonarji ta' IRF1 (Figura 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, u ISG15) instabu li ġew indotti b'mod qawwi wara 6 sigħat, li jimitaw ir-risponsi klassiċi tal-fażi tan-nofs u tard għal IFNα (Figura 1A).Flimkien, din id-dejta tissuġġerixxi li dan il-mudell ċellulari jista 'jintuża biex jistudja r-risponsi tal-interferon.
Risposti differenzjali ta 'espressjoni ta' proteina fiċ-ċelloli Flo-1 wara trattament IFNα.(A) L-espressjoni tal-proteina fiċ-ċelloli Flo-1 ittrattati b'10 ng/ml IFNα għal 2, 6, 24, 48 u 72 siegħa ġiet analizzata b'immunoblot bl-użu tal-antikorpi ISG indikati.(B) Ġellijiet SDS-PAGE mtebbgħin blu Coomassie ta 'estratti ta' ċelluli sħaħ wara cross-linking ma 'DSS għal ħinijiet u konċentrazzjonijiet indikati.(C) Immunoblot rappreżentattiv eżaminat b'antikorp p53(DO-1) mill-istess kampjuni biex jivvaluta l-grad ta 'cross-linking tal-proteini.
Biex taqbad il-pajsaġġ ta 'interazzjoni tal-proteini in situ, użajna DSS, aġent ta' cross-linking użat ħafna minħabba l-permeabilità għolja tal-membrana tiegħu u ħin ta 'reazzjoni relattivament qasir.Il-ħin ta 'reazzjoni iqsar jgħin biex jipprevjeni l-formazzjoni ta' aggregati kbar ta 'proteini crosslinked, u b'hekk tinżamm l-istabbiltà tal-crosslinker.Biex tiddetermina l-aħjar konċentrazzjoni DSS u nevitaw over-crosslinking, l-ewwel esponejna ċ-ċelloli għal 5, 2.5, u 1 mM DSS għal 5, 10, 5, u 30 minuta, rispettivament, u analizzajna l-lysates b'SDS-PAGE imtebba b'Coomassie (data mhux murija) .Lisati taċ-ċelluli jidhru li huma cross-linked ħafna fl-inqas konċentrazzjoni u fl-iqsar punt ta 'żmien.Għalhekk, DSS ġie ttitrat għal 1, 0.5, u 0.1 mM fuq 5 minuti (Figura 1B).Crosslinking ottimali kien osservat b'0.5 mM DSS għal 5 minuti, u dawn il-kundizzjonijiet ġew magħżula għal ċelloli ttrattati b'IFNα.Barra minn hekk, il-Figura 1C turi Western blot imwettaq bl-użu tal-antikorp p53 (DO-1) biex jivvaluta l-grad ta 'cross-linking tal-proteini.
Iċ-ċelloli Flo-1 ġew ittrattati b'10 ng/ml IFNα għal 24 siegħa qabel ma żżid il-crosslinker.Iċ-ċelloli cross-linked ġew sussegwentement lisati permezz ta 'proteolysis f'żewġ stadji u l-proteini ġew ipproċessati mill-FASP (Fig. 2) 24,25.Peptidi tryptic cross-linked ġew analizzati bl-ispettrometrija tal-massa (Fig. 2).L-ispettri MS/MS huma mbagħad imqabbla mas-sekwenza tal-proteini u kkwantifikati b'MaxQuant26,27.Peptidi cross-linked ġew identifikati mill-ispettri miksuba bl-użu tal-programm SIM-XL, u komposti individwali ġew magħquda f'netwerk kumpless bl-użu tal-pipelines ta 'softwer tal-kompjuters ta' sors miftuħ xQuest28 u SIM-XL29 (Fig. 2).SIM-XL jidentifika interazzjonijiet proteini-proteini, ktajjen interni u ktajjen individwali f'taħlitiet ta 'proteini sempliċi jew kumplessi u jipprovdi skripts għall-viżwalizzazzjoni ta' interazzjonijiet fi strutturi ta 'proteini.Barra minn hekk, tikklassifika kull referenza inkroċjata bħala punteġġ tal-ID skont il-kwalità tal-ispettru MS/MS29.Ġew identifikati diversi interazzjonijiet u kumplessi ta 'proteini-proteini affidabbli ħafna, u sett ġdid ta' interazzjonijiet ġie investigat aktar bl-użu ta 'ko-immunoprecipitation u bidliet konformazzjonali ta' kumplessi bl-użu ta 'mudellar ta' dinamika molekulari (MD) (Fig. 2) 30, 31.
Ħarsa ġenerali skematika tal-metodu CLMS.Iċ-ċelloli Flo-1 ġew ittrattati b'10 ng/ml IFNα għal 24 siegħa segwiti minn cross-linking tal-proteini in situ bl-użu ta 'DSS segwit minn liżi taċ-ċelluli u trypsinization.Kampjuni cross-linked ġew analizzati bl-użu ta' spettrometru tal-massa Orbitrap u ttieħdu kampjuni ulterjuri għall-frammentazzjoni tal-prekursuri tal-peptidi waqt LC-MS/MS.Żewġ peptidi konnessi ġew identifikati mill-ispettri miksuba bl-użu tal-Magni tar-Rikonoxximent tal-Ispettru tal-programm Crosslinked Peptides (SIM-XL), u l-komposti kollha ġew magħquda f'netwerk kumpless bl-użu ta 'pipelines komputazzjonali.Iffiltra interazzjonijiet ta' kunfidenza baxxa bbażati fuq punteġġi tar-rata pożittiva falza (FDR).Diversi interazzjonijiet ġodda ta 'fedeltà għolja proteina-proteina ġew ikkonfermati aktar bl-użu ta' ko-immunopreċipitazzjoni, u bidliet konformazzjonali fil-kumplessi ġew eżaminati bl-użu ta 'mudellar ta' dinamika molekulari (MD).
Total ta '~30,500 u ~ 28,500 peptidi ġew skoperti bl-użu ta' MaxQuant f'kampjuni ta 'IFNα mhux stimulati u stimulati, rispettivament (Tabella Supplimentari S1, Fig. 3A).Id-distribuzzjoni tat-tul tal-peptidi fiż-żewġ każijiet wriet proporzjon ogħla ta 'peptidi akbar, li jindika l-preżenza ta' peptidi cross-linked (Fig. 3B, C).Barra minn hekk, proporzjon akbar ta 'peptidi akbar kienu preżenti fil-medda 40-55 f'kampjuni ttrattati b'IFNα (Fig. 3C).L-immappjar tal-proteini kontra l-intensità log2 wera li l-proteini klassiċi stimulati mill-interferon kienu l-aktar abbundanti meta mqabbla ma 'kampjuni mhux ittrattati, inklużi MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, u HLA-F (Figura 3D).Analiżi ta 'mogħdijiet għal proteini aktar minn tliet darbiet arrikkit b'reazzjoni għal trattament IFNα bl-użu tad-database tal-mogħdija Reactome uriet li l-preżentazzjoni u l-ipproċessar tal-antiġeni medjati mill-MHC-I kienu l-aktar mogħdija dominanti (Figura 3E).B'mod konsistenti ma 'rapporti preċedenti, risponsi antivirali medjati minn OAS u ISG15 kif ukoll IFNα/β u sinjalazzjoni taċ-ċitokini kienu fost il-mogħdijiet attivati.Barra minn hekk, il-cross-links tal-proteini speċifiċi għall-lisina u s-serina ġew identifikati mill-ispettri MS/MS akkwistati oriġinarjament bl-użu ta 'SIM-XL.Studju reċenti rrapporta 104 ISG li jkopru 20 virus minn 9 klassijiet ta 'virus permezz ta' meta-analiżi ta 'studji individwali ta' espressjoni żejda ISG f'5 tipi ta 'ċelluli9.Madankollu, biex negħlbu l-limitazzjonijiet komputazzjonali tal-iskrinjar ta 'settijiet ta' dejta kbar, bdejna b'sett ta 'dejta iżgħar biex nesploraw interazzjonijiet possibbli bejn il-lista ta' ġeni IRDS irrappurtati minn Padaria et al., li ħafna minnhom huma ISGs.
Identifikazzjoni ta' proteini cross-linked espressi b'mod differenzjat bi tweġiba għal IFNα (dejta miksuba minn MaxQuant).(A) Dijagramma Venn li tirrappreżenta n-numru ta 'peptidi komuni u esklussivi identifikati f'kampjuni Flo-1 trattati u mhux ittrattati b'IFNα14.Distribuzzjoni tat-tul tal-peptidi ta' kampjuni crosslinked mhux ittrattati (B) u trattati IFNα (C).(D) Mappa tas-sħana li tirrappreżenta log2 (intensità LFQ) bejn ċelluli Flo-1 mhux ittrattati u trattati IFNα14.Il-pannell tax-xellug juri l-proteini l-aktar attivati ​​b'mod attiv fil-preżenza ta 'IFNα.(E) Istogramma li tirrappreżenta l-20 mogħdija ewlenija ta 'arrikkiment wara t-trattament ta' IFNα.Id-database tal-mogħdija ta 'Reactome analizzat aktar minn erba' darbiet bidliet fil-proteini li jirrispondu għal IFNα upregulated.
L-istimulazzjoni tal-ISG medjata mill-interferon hija dokumentata tajjeb, iżda fil-livell molekulari huwa mifhum ħażin kif dawn il-proteini jilħqu l-qofol tagħhom f'firxa wiesgħa ta 'funzjonijiet bijoloġiċi.Aħna investigajna l-interazzjonijiet tal-proteini bi grad għoli ta 'kunfidenza bejn ISGs magħrufa.Interessanti, identifikajna netwerk li jinkludi proteini MX1, USP18, ROBO1, OAS3 u STAT1 li jiffurmaw kumpless kbir b'reazzjoni għat-trattament IFNα (Figura 4, Tabella S2) 32,33,34.L-iktar importanti, dawn l-interazzjonijiet instabu fit-triplikati kollha ttrattati b'IFNα u ma nstabux f'kampjuni mhux ittrattati, li jissuġġerixxi li ġew iffurmati speċifikament b'reazzjoni għat-trattament b'IFNα.Huwa magħruf li STAT1 jirregola b'mod traskrizzjoni l-espressjoni ta 'dawn l-ISGs, iżda l-interazzjoni tiegħu ma' ISGs fil-livell tal-proteini ma ġietx studjata.L-istruttura tal-kristall ta 'STAT1 wriet li d-dominju helical (CCD) tiegħu mhuwiex involut fl-interazzjoni mad-DNA jew mal-protomeri matul il-formazzjoni ta' dimeri35.Dawn l-α-helix jiffurmaw struttura helix helix li tipprovdi erja tal-wiċċ predominantement idrofilika għall-interazzjonijiet li jseħħu 35 .Fid-dejta tas-CLMS tagħna, osservajna li ħafna mill-interazzjonijiet ma 'STAT1 seħħew fid-dominju SH2 qabel is-CCD, id-dominju tal-linker, jew id-denb C-terminal (residwi 700-708) (Figura 4A).Studju preċedenti rrapporta li USP18 jingħaqad mal-CCD u d-dominju li torbot id-DNA (DBD) ta 'STAT2 u huwa rreklutat għas-subunità tar-riċettur tal-interferon tat-tip I IFNAR2 biex jimmedja l-inibizzjoni tas-sinjalar tal-interferon tat-tip I 24 .Id-dejta tagħna wriet ukoll li d-dominju katalitiku USP18 jinteraġixxi ma 'STAT1 DBD (Figura 4A, D), li jissuġġerixxi li kemm STAT1 kif ukoll STAT2 jista' jkollhom rwol biex jattiraw USP18 għal IFNAR2.
Netwerk ISG proteina-proteina identifikat f'ċelloli cross-linked ittrattati b'IFNα.(A) Plott ta 'interazzjoni 2D li turi interazzjonijiet proteina-proteina (ġenerati fil-programm SIM-XL), b'linji li jirrappreżentaw interazzjonijiet intermolekulari (cutoff crosslink issettjat għal 3.5).Dominji ta' identitajiet differenti huma mmarkati bil-kulur32 tagħhom: dominju MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547), u GED (569–660).Dominji OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), u OAS1_C (903-108).Dominju ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) u fn3 (777–864).Fields STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), u STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Telespettatur ċirkolari ta 'proteini cross-linked (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, u STAT1) b'interazzjonijiet u interazzjonijiet immarkati bil-blu u bl-aħmar, rispettivament.Il-limitu tal-cross-link ġie stabbilit għal 3.5.Dot plots jindikaw siti ta 'interazzjoni STAT1 ma' MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), u OAS3 (F), kif ukoll siti ta 'interazzjoni K jew S bejn iż-żewġ peptidi.Fil-figura, il-limitu tal-punteġġ tal-cross-link huwa ssettjat għal 3.0.(G) Diversi siti ta 'interazzjoni bejn id-dominji STAT1 u OAS3 DI superimposti fuq l-istrutturi tal-proteini tagħhom f'PyMol (sistema ta' grafika molekulari PyMOL, verżjoni 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) u OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programm.
Żewġ iżoformi ta 'USP18 ġew deskritti fil-bnedmin, proteina ta' tul sħiħ li tinsab prinċipalment fin-nukleu, u iżoforma mingħajr dominju N-terminal, USP18-sf, li hija mqassma b'mod ugwali fiċ-ċitoplasma u n-nukleu 36 .Barra minn hekk, l-N-terminus kien imbassar li ma jkunx strutturat u ma jeħtieġx attività isopeptidase jew irbit ta 'ISG1537.Ħafna mill-interazzjonijiet identifikati fl-istudju tagħna kienu jinsabu fit-tmiem N tal-proteina, li jissuġġerixxu li dawn l-interazzjonijiet jinvolvu USP18 full-length (Figura 4A, D) u għalhekk x'aktarx iseħħu fin-nukleu.Barra minn hekk, id-dejta tagħna tindika wkoll li l-N-terminal huwa speċjalizzat għal interazzjonijiet bejn proteini u proteini.Is-sit li jgħaqqad IFNAR2 jinsab bejn ir-residwi 312-368, u notevolment, l-ebda proteini fil-kumpless ma jorbot ma 'dan ir-reġjun (Fig. 4A) 37,38.Din id-dejta meħuda flimkien tindika li d-dominju li torbot IFNAR2 jintuża esklussivament mill-proteina tar-riċettur.Barra minn hekk, OAS3 u ROBO1 biss instabu li huma assoċjati ma 'dominji upstream tal-N-terminus u IFNAR2 sit ta' rbit (Figura 4A).
ROBO1 jappartjeni għas-superfamilja ta 'immunoglobulina (Ig) ta' molekuli ta 'sinjalazzjoni transmembrana u jikkonsisti f'ħames oqsma Ig u tliet oqsma fibronectin (Fn) fir-reġjun extraċellulari.Dawn id-dominji extraċellulari huma segwiti minn reġjun prossimali tal-membrana u helix transmembrana waħda 39. Reġjun intraċellulari mhux strutturat jinsab fis-C-terminal u fih motivi ta 'sekwenza kkonservati li jimmedjaw l-irbit tal-proteini effettur39.Ir-reġjun li jestendi minn aċidi amminiċi ~ 1100 sa 1600 huwa l-aktar diżordinat.Sibna li MX1 jinteraġixxi ma 'ROBO1 permezz ta' oqsma Ig, Fn, u intraċellulari, filwaqt li l-biċċa l-kbira tal-interazzjonijiet ma 'STAT1 iseħħu bejn is-CCD, id-dominju tal-linker, u t-terminal C ta' ROBO1 (Fig. 4A, E).Min-naħa l-oħra, interazzjonijiet ma 'DI, DIII, u reġjuni linker OAS3 kienu mqassma matul il-proteina ROBO1 (Fig. 4A).
Il-familja tal-proteini tal-oligoadenylate synthase (OAS) taċċetta u torbot RNA intraċellulari double-stranded (dsRNA), tgħaddi minn bidliet konformazzjonali, u sintetizza oligoadenylates marbuta ma' 2',5' (2-5 As) 40 .Instab li fost it-tliet OASs, OAS3 juri l-ogħla affinità għad-dsRNA u jissintetizza l-inqas ammont ta '2-5 As, li jista' jattiva RNase L u b'hekk jillimita r-replikazzjoni virali 41 .Il-familja OAS tikkonsisti f'dominji ta' nucleotide transferase simili ta' polymerase beta (pol-β).Riċerka preċedenti wriet li l-attività katalitika tad-dominju C-terminal (DIII) hija dipendenti fuq id-dominju li torbot dsRNA (DI), li huwa meħtieġ għall-attivazzjoni ta 'OAS342.Aħna osservajna li d-dominji DI u DII ta 'OAS3 jinteraġixxu ma' CCD u reġjun ta 'junction żgħir bejn SH2 u STAT1 TAD (Figura 4A, F).Is-siti ta 'crosslinking differenti fuq l-istruttura tal-proteini żvelaw interazzjoni bejn il-linja β-sheet u DBD STAT1 u but miftuħ jew kavità ffurmata minn residwi 60-75 fid-dominju DI ta' OAS3 (Fig. 4G).L-orjentazzjoni tal-proteini fil-kumpless indikat ukoll li l-ebda waħda mill-interazzjonijiet ma 'OAS3 interferiet mal-kapaċità ta' rbit tad-DNA tad-dominju DI tagħha (Fig. S1A).Barra minn hekk, id-dominju N-terminal ta 'GTPase MX1 jinteraġixxi b'mod estensiv mad-dominji DI u DIII ta' OAS3 (Fig. 4A).Aħna osservajna wkoll interazzjoni bejn OAS1 u MX1 fit-tliet ripetizzjonijiet ittrattati b'IFNα, fejn dominju wieħed OAS1 (ukoll attiv katalitikament) interaġixxa mat-tliet oqsma MX1 kollha (Figura S2A, B).
Il-proteini MX huma parti minn familja kbira ta’ GTPases li jixbħu d-dynein li fihom dominju N-terminal GTPase li jorbot u idrolizza GTP, dominju intermedju li jimmedja l-awto-assemblaġġ, u biż-żippijiet tal-leucine C-terminal li jaġixxi bħala GTPase (LZ). ).domain effector domain25,43.MX1 jingħaqad ma' subunitajiet ta' polimerasi virali biex jimblokka t-traskrizzjoni tal-ġene virali43.Skrin ta 'żewġ ibridi tal-ħmira rappurtat qabel wera li MX1 assoċjat ma' PIAS1 jinibixxi l-attivazzjoni tal-ġeni medjata minn STAT1 billi jimblokka l-attività li torbot id-DNA u għandu wkoll attività ligase SUMO E344,45.Hawnhekk, aħna nuru li MX1 jeħel ma 'STAT1 (Figura 4C, D), madankollu kif din l-interazzjoni taffettwa l-attivazzjoni tal-ġeni medjata minn STAT1 b'reazzjoni għal IFNα teħtieġ aktar studju.Barra minn hekk, sibna wkoll li MX1 interaġixxa ma 'IFIT3 u DDX60 fit-tliet ripetizzjonijiet ittrattati b'IFNα (Fig. S2C).
DDX60 huwa helicase ċitoplasmiku indott minn IFN li qabel ġie rrappurtat li għandu rwol fid-degradazzjoni indipendenti minn RIG-I ta 'RNA46 virali.Jinteraġixxi ma' RIG-I u jattiva s-sinjalar tiegħu b'mod speċifiku għal ligand 46. DDX60 jikkonsisti f'dominju helicase DEXD/H-Box u dominju helicase C-terminal li jgħaqqad l-RNA virali u d-DNA47.Ħafna mill-interazzjonijiet tagħha ma 'MX1 u IFIT3 iseħħu f'reġjuni twal N- u C-terminali mingħajr oqsma jew motifi kanoniċi (Fig. S2E, F).Madankollu, MX1 huwa assoċjat ukoll mad-dominju helicase DEXD/H-Box (Fig. S2E).Proteini tal-familja IFIT għandhom kopji tandem ta 'motif distintiv helix-dawran-helix imsejjaħ it-tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 instab li kien modulatur pożittiv tas-sinjalar RIG-I u għalhekk komponent tal-kumpless MAVS.Meħuda flimkien, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li IFIT3 u DDX60 jinteraġixxu primarjament fir-reġjun bejn TPR 3-6 ta 'IFIT3 u jista' jkollha rwol fis-sinjalar RIG-I/MAVS (Fig. S2F).
Minħabba li l-iskrinjar tal-proteome kollu huwa komputazzjoni intensiv, aħna mbagħad skrinjajna d-database UniProt umana kollha għall-preżenza ta 'waħda mir-repetizzjonijiet ittrattati b'IFNα.F'din ir-replika, sibna diversi netwerks ta' interazzjoni affidabbli ħafna għal HLA-A.Analiżi tal-mogħdijiet tal-proteini identifikati mill-ispettri MS/MS wriet li l-ipproċessar u l-preżentazzjoni tal-antiġeni bbażati fuq MHC-I hija l-mogħdija ewlenija indotta mill-interferon (Fig. 3D).Għalhekk, aħna ffukajna fuq l-istudju tal-interazzjonijiet tal-proteini tal-molekuli MHC-I bi grad għoli ta 'kunfidenza fil-kampjuni kollha cross-linked.HLA jikkonsisti f'dominji α1, α2 u α3 u ktajjen ħfief, u l-mikroglobulina β2 (β2m) hija proteina chaperone kostanti49.Ladarba immuntat fir-retikulu endoplasmiku, HLA huwa instabbli fin-nuqqas ta 'ligands peptidi50.Il-kanal li jgħaqqad il-peptidi huwa ffurmat mid-dominji α1 u α2 polimorfiċi ħafna u mhux strutturati f'forma mhux peptide u d-dominju α351 relattivament inqas polimorfiku.Fil-preżenza ta 'IFNα, skoprejna żewġ kumplessi HLA-A: wieħed jinteraġixxi ma' HMGA1 u H2B (Figura 5, Tabella S3) u l-ieħor jinteraġixxi ma 'MDN1, LRCH4 u H2B (Figura 6).
IFNα jinduċi netwerk ta 'interazzjoni HLA-A ma' H2B (H2BFS) u HMGA1.(A) Plott 2D (iġġenerat fis-softwer SIM-XL) li juri tipi differenti ta 'interazzjonijiet fil-kumpless H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (blu), interlink (aħmar) u rabta waħda (iswed)..Dominji ta' identitajiet differenti huma kkodifikati bil-kulur32: H2B (histone; 2–102) u MHC-I (MHC_1; 25–203, grupp C1; 210–290 u MHC_I_C; 337–364).Il-limitu tal-cross-link ġie stabbilit għal 3.5.Dot plots jindikaw siti ta 'interazzjoni HLA-A ma' H2B (B) u HMGA1 (C), kif ukoll siti ta 'interazzjoni K jew S bejn iż-żewġ peptidi.Fil-figura, il-limitu tal-punteġġ tal-cross-link huwa ssettjat għal 3.0.(D) Relazzjonijiet bejn il-proteini murija fl-istrutturi tal-proteini H2B, HLA-A, u HMGA1 fil-programm PyMOL.Dawn l-istrutturi ġew immudellati bl-użu tas-server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) u l-istrutturi tal-mudelli għall-proteini H2B, HLA-A u HMGA1 kienu 1kx552, 1kj349 u 2eze55, rispettivament.
IFNα jinduċi netwerk ta 'interazzjoni HLA-A ma' H2B (H2BFS), MDN1 u LRCH4.(A) Crosslinks intramolekulari (aħmar) u intermolekulari (blu) ippreżentati fuq mappa interattiva 2D (ġenerata fis-softwer SIM-XL) b'MDN1 rappreżentat bħala ċirku.Il-limitu tal-cross-link ġie stabbilit għal 3.5.Dominji ta' identitajiet differenti huma kkodifikati bil-kulur32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupp C1; 210–290 u MHC_I_C; 337–364) u LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) u CH (535–641)).(B) Relazzjonijiet bejn il-proteini murija fl-istrutturi tal-proteini H2B, HLA-A, LRCH4, u MDN1 fil-programm PyMOL.Dawn l-istrutturi ġew immudellati bl-użu tas-server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) bi strutturi template 1kx552, 1kj349, 6hlu62 u 6i2665 għall-proteini H2B, HLA-A, LRCH4 u MDN1, rispettivament.Dot plots li juru siti ta' interazzjoni K jew S għal HLA-A ma' H2B (C), LRCH4 (D), u MDN1 (E).Għall-plots, il-limitu tal-punteġġ tal-cross-link ġie stabbilit għal 3.0.
Minbarra li żżomm l-integrità tal-ġenoma, histone H2B hija involuta wkoll fir-regolamentazzjoni tat-traskrizzjoni.Il-proteina H2B tikkonsisti f'dominju tal-histone ċentrali (HFD) iffurmat minn tliet α-helizes separati minn loops u denb C-terminal 41,52.Ħafna mill-interazzjoni ma 'H2B isseħħ fil-helix α1, li tipprovdi trimerizzazzjoni bl-eterodimer HFD (Fig. 5A, B).Għalkemm il-lysins huma involuti fl-irbit tad-DNA, xi lysins huma wkoll siti alternattivi ta' aċetilazzjoni jew metilazzjoni.Pereżempju, ir-residwi K43, K46, u K57 minn H2B mhumiex involuti fit-twaħħil dirett tad-DNA, iżda huma miri ta 'diversi modifiki wara t-traskrizzjoni53.Bl-istess mod, residwi K44, K47, u K57 f'H2B jista 'jkollhom rwol alternattiv fil-preżenza ta' IFNα, inklużi interazzjonijiet ma 'proteini oħra (Fig. 5A, B).Barra minn hekk, l-istone extrachromosomal H2B jattiva r-rispons immuni f'diversi tipi ta 'ċelluli, li jaġixxi bħala sensor cytosolic biex jikxef frammenti tad-DNA bi strand doppju (dsDNA) derivati ​​minn aġenti infettivi jew ċelluli bil-ħsara54.Fil-preżenza ta 'viruses tad-DNA, it-tnaqqis ta' H2B inibixxi l-produzzjoni ta 'IFN-β u l-fosforilazzjoni STAT154.L-H2B huwa magħruf ukoll li jimxi 'l ġewwa u 'l barra min-nukleu aktar malajr minn istoni ewlenin oħra54.Interazzjonijiet H2B ma 'MDN1 u LRCH4 ġew osservati wkoll f'kampjuni magħżula mhux ittrattati.Aħna sibna li HLA-A interaġixxa ma 'H2B fit-tliet kampjuni ttrattati b'IFNα u f'kampjun wieħed ripetut mhux ittrattat.Din id-dejta tirrifletti r-rwol ta 'H2B f'funzjoni fiżjoloġika alternattiva indipendenti mir-regolamentazzjoni tat-traskrizzjoni.
HMGA1 (grupp ta 'mobilità għolja AT-Hook 1), nukleoproteina żgħira rikka f'aċidi amminiċi li jippromwovu l-mard, ġiet identifikata f'assoċjazzjoni ma' HLA-A.Għandu denb C-terminal aċiduż u tliet DBD distinti msejħa AT ganċijiet minħabba li jorbtu mal-kanal minuri tar-reġjun rikk fl-AT f'dsDNA55,56.Dan it-twaħħil jikkawża li d-DNA jitgħawweġ jew jiddritta, u jippermetti lill-fatturi ta 'traskrizzjoni kanoniċi jaċċessaw is-sekwenza ta' kunsens tiegħu.Id-denb C-terminal huwa maħsub li huwa involut f'interazzjonijiet proteina-proteina u r-reklutaġġ ta 'fatturi ta' traskrizzjoni, peress li mutanti ta 'tħassir C-terminal ma jistgħux jibdew traskrizzjoni57.Barra minn hekk, dan id-dominju fih diversi siti ta' fosforilazzjoni kkonservati li huma sottostrati magħrufa għal kinases 58 .Aħna osservajna interazzjonijiet HLA-A u H2B ma 'HMGA1 barra mid-dominju C-terminal, li jissuġġerixxi li d-dominju C-terminal jintuża prinċipalment għall-irbit tal-fattur ta' traskrizzjoni (Fig. 5A, C).Il-proteini HMGA jikkompetu mal-histone H1 biex jorbtu mad-DNA tal-adapter, u b'hekk tiżdied l-aċċessibbiltà57.Bl-istess mod, jidher probabbli li l-HMGA jinteraġixxi mal-histone H2B tul il-linker DNA f'kompetizzjoni mal-histone H1.HMGB1 jinduċi l-espressjoni ta 'HLA-A, -B, u -C fiċ-ċelloli dendritiċi, li jwassal għall-attivazzjoni tagħhom59, iżda interazzjoni bejn HMG u HLA ma ġietx irrappurtata qabel.Sibna li HMGA1 jinteraġixxi mad-dominji α1 u α3 ta 'HLA-A, bil-biċċa l-kbira tal-interazzjonijiet barra mit-3 DBD tiegħu (Figura 5A, C).F'idejna, HLA-A instab li kien lokalizzat fin-nukleu (dejta mhux murija), u peress li H2B u HMGA1 huma wkoll preżenti fin-nukleu, din l-interazzjoni x'aktarx isseħħ fin-nukleu.Adducts speċifiċi mkejla bejn H2B, HLA-A, u HMGA1 huma murija fil-Figura 5D.
Il-biċċa l-kbira tal-interazzjonijiet ta 'HLA-A ma' proteini oħra jseħħu fi ħdan id-dominji α1 u α2 tiegħu u d-dominju C-terminal diżordinat (Fig. 6).F'wieħed minn dawn l-eżempji, sibna li HLA-A jinteraġixxi mad-denb N-terminal diżordinat ta 'LRCH4 (Figura 6A, D).LRCH4 jirregola l-attivazzjoni ta 'TLR4 u l-induzzjoni taċ-ċitokini LPS, u b'hekk jimmodula r-rispons immuni innat60,61.Hija proteina tal-membrana b'disa' ripetizzjonijiet b'ħafna lewċina (LRRs) u motif omoloġija ta' calmodulin (CH) fl-ectodomain tagħha, segwit minn dominju transmembrane (TMD) 60, 62 .Domains CH ġew irrappurtati li jimmedjaw interazzjonijiet proteina-proteina 60 .Stretta ta' madwar 300 aċidu amminiku bejn id-dominji LRR u CH hija relattivament aċċessibbli iżda diżordinata.Ibbażat fuq il-funzjoni ta 'reġjuni diżordinati bħala medjaturi ta' netwerks ta 'proteini-proteini u trasport vesikulari 63, sibna li l-biċċa l-kbira tal-interazzjonijiet tal-proteini jseħħu f'reġjuni diżordinati.L-interazzjonijiet ma 'MDN1 kienu mqassma tul it-tul tal-proteina, inklużi d-dominji LRR1, LRR6, CH, u reġjuni każwali, filwaqt li H2B prinċipalment marbut mad-dominju CH (Fig. 6A, B).Notevolment, l-ebda waħda mill-interazzjonijiet ma kienet tinkludi t-TMJ, li tissuġġerixxi l-ispeċifiċità tal-approċċ CLMS (Figura 6A, B).
MDN1 ġie identifikat ukoll bħala parti min-netwerk tal-proteini HLA-A (Figura 6A).Jappartjeni għall-familja AAA ta 'proteini (ATPases assoċjati ma' attivitajiet differenti).Dan huwa l-istess dominju AAA N-terminal li jorganizza f'ċirku eżameriku u jneħħi l-fattur ta 'assemblaġġ mis-subunità ribosomali 60S 64.jidher li huwa simili għal dynein64,65,66.Barra minn hekk, ir-reġjun għani Asp/Glu huwa segwit mid-dominju MIDAS (sit dipendenti fuq il-jone tal-metall).Minħabba d-daqs kbir ta 'MDN1 (madwar 5600 aċidu amminiku) u l-omoloġija limitata tiegħu ma' proteini studjati sew, ftit huwa magħruf dwar l-istruttura u l-funzjoni tiegħu fil-bnedmin.Aħna identifikajna HLA-A, H2B, u LRCH4 bħala msieħba li jorbtu MDN1 u żvelaw l-orjentazzjoni tagħhom bħala kumplessi ta 'proteini f'PyMol (Fig. 6A, B).Dawn it-tliet proteini jinteraġixxu mad-dominju AAA, id-dominju tal-linker bħal dynein, u possibbilment id-dominju MIDAS MDN1.F'rapport preċedenti, purifikazzjoni ta 'affinità ta' proteini tal-lixka identifikat MDN1 bħala proteina assoċjata ma 'histone H2B67.Barra minn hekk, studju reċenti rrapporta wkoll interazzjoni bejn MDN u HLA-B fiċ-ċelloli HCT116 bl-użu ta 'spettrometrija tal-massa purifikata bl-affinità, li jappoġġja s-sejbiet tagħna68.L-identifikazzjoni ta 'dan il-kumpless f'kampjuni ttrattati b'IFNα tissuġġerixxi rwol għal MDN1 fis-sinjalar tal-interferon.
Minħabba li l-ġeni HLA huma polimorfiċi ħafna, estrajna s-sekwenzjar taqra l-immappjar ta 'HLA-A, -B, u -C mid-dejta tas-sekwenzjar tal-RNA taċ-ċelloli Flo-1 (dejta mhux murija).Sekwenzi tal-peptidi konsistenti mal-qari tas-sekwenzjar wrew differenzi sinifikanti bejn HLA-A, -B, u -C f'reġjuni fejn il-peptidi cross-linked kienu jinsabu f'HLA-A (Figura S3).Barra minn hekk, aħna ma osservajnax cross-linking bejn proteini u proteini ta 'molekuli HLA-B/C ma' proteini H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Dan jissuġġerixxi li l-interazzjoni tal-proteini misjuba bejn HLA-A, MDN1, LRCH1 u HMGA1 hija speċifika għal HLA-A.Barra minn hekk, analiżi proteomika ta 'kampjuni mhux crosslinked (Tabella S4) wriet li HLA-A għandu kopertura ta' sekwenza ogħla meta mqabbel ma 'HLA-B jew HLA-C.Il-peptidi identifikati għal HLA-A kienu ta 'intensità għolja kemm f'kampjuni ttrattati b'IFNα kif ukoll mhux ittrattati.
Biex niżguraw li l-interazzjonijiet identifikati hawn ma kinux dovuti għal cross-linking mhux speċifiku ta 'żewġ proteini fi prossimità spazjali mill-qrib, aħna kkonfermajna aktar żewġ fatturi ġodda ta' interazzjoni HLA-A billi wettaq analiżi ta 'ko-immunopreċipitazzjoni.Interazzjonijiet HLA-A ma 'MDN1 u H2B endoġeni ġew skoperti kemm f'ċelluli Flo-1 ittrattati b'IFNα kif ukoll mhux ittrattati (Figura 7, Figura S4).Aħna kkonfermajna li HLA-A nqabad minn H2B fl-immunoprecipitati u li din l-assoċjazzjoni kienet dovuta għal trattament IFNα peress li HLA-A kien assenti fil-kampjuni ta 'immunoprecipitate minn ċelluli mhux ittrattati (Figura 7A).Madankollu, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li IFNα jirregola b'mod differenzjat l-irbit ta 'HLA-A ma' H2B u MDN1.IFNα jinduċi assoċjazzjoni bejn H2B u HLA-A, iżda jnaqqas l-assoċjazzjoni tiegħu ma 'MDN1.Sibna li MDN1 kien assoċjat ma 'HLA-A fil-kontrolli, u ż-żieda ta' IFNα naqqset din l-interazzjoni indipendenti mill-induzzjoni MDN1 minn IFNα (Figura 7B, C).Barra minn hekk, l-immunopreċipitazzjoni HLA-A qabdet H2B fiċ-ċelloli A549 (Fig. S4), li tissuġġerixxi li din l-interazzjoni hija indipendenti mit-tip ta 'ċellula.Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jappoġġjaw interazzjonijiet medjati minn interferon ta 'HLA-A ma' H2B u MDN1.
HLA-A jippurifika H2B u MDN1.Immunoblots H2B (A) u MDN1 (B) endoġeni rappreżentattivi ġew immunoprecipitati minn ċelluli Flo-1 ittrattati b'IFNα u sondati għall-antikorpi indikati.IgG tal-ġrieden u tal-fenek intużaw bħala kontroll negattiv.(C) Ammonti relattivi (input) ta 'antiġeni differenti huma murija minn immunoblots sondati kontra antikorpi indikati, β-actin intuża bħala kontroll tat-tagħbija.
Il-proprjetajiet strutturali ta 'wieħed min-netwerks cross-linked affidabbli ħafna indotti mill-interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, ġew investigati.Aħna użajna l-immudellar tad-dinamika molekulari bħala approċċ alternattiv biex nifhmu d-dinamika konformazzjonali tal-proteini involuti f'dan il-kumpless (Figura 8).Inferenzi mid-dejta CLMS jissuġġerixxu l-possibbiltà ta 'konformazzjonijiet differenti tal-proteini H2B, HLA-A, u HMGA1.Għalhekk, il-kumplessi potenzjali li ġejjin ġew immudellati f'mezz solvent: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, u H2B-HLA-A-HMGA1.Skrin inizjali ta 'docking ta' proteini-proteini bl-użu tal-pakkett MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) issuġġerixxa konformazzjonijiet possibbli li huma differenti bejn dawn il-proteini (Fig. 8A).Il-viżwalizzazzjoni tal-kumpless tal-proteini tad-docking żvelat diversi interazzjonijiet u konformazzjonijiet possibbli (Figura 5A, 8).Għalhekk, konformazzjoni waħda possibbli hija murija fil-Figura 8A (b'cross-links ittikkettjati) u ġiet evalwata aktar bl-użu tal-pipeline tal-immudellar MD.Barra minn hekk, it-twaħħil ta 'H2B jew HMGA1 ma' HLA-A jenfasizza l-affinità ogħla ta 'H2B għal HLA-A (Fig. 8A).
Dinamika konformazzjonali ta 'netwerks possibbli bejn il-kumplessi H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A, u H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Il-pannell tax-xellug huwa mappa 2D (ġenerata fis-softwer SIM-XL) ta 'crosslinks intramolekulari (aħmar) u intermolekulari (blu) (crosslink cutoff issettjat għal 3.5).Barra minn hekk, residwi ta 'cross-linking identifikati huma ttikkettjati fuq l-istrutturi tal-proteini H2B, HLA-A, u HMGA1.Il-konformazzjonijiet assoċjati ta 'dawn il-proteini ġew estratti bl-użu tal-pipeline ta' docking implimentata fil-pakkett MOE.Il-pannell tax-xellug t'isfel juri d-diversi konformazzjonijiet possibbli tal-kumplessi H2B-HLA-A u HMGA1-HLA-A b'affinitajiet differenti ta 'rbit proteini-proteini (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Devjazzjoni standard (RMSD) tal-pożizzjonijiet atomiċi (esklużi l-atomi tal-idroġenu) għal kull struttura tal-proteina.(C) Interazzjonijiet intermolekulari proteina-proteina idroġenu bond minn diversi kumplessi simulati meta jitqiesu interazzjonijiet speċifiċi ta 'tul ≥ 10 ns.Id-distanza tal-qtugħ tad-donatur-aċċettatur tal-h-bond ġiet issettjata għal 3.5 Å, u l-angolu tal-qtugħ tad-donatur-H-aċċettatur ġie ssettjat għal ≥ 160 °-180 °.(D) Residwi ttikkettjati li jiffurmaw interazzjonijiet proteina-proteina HLA-A mal-imsieħba rispettivi tagħhom, li jkopru ≥ 20 ns, estratti minn kumplessi HLA-A-H2B u HLA-A-HMGA1 finta.L-istrutturi tal-proteini jirrappreżentaw struttura medja ta '100 ns MDS.(E) Interazzjonijiet bejn il-kumplessi HLA-A-H2B u HLA-A-HMGA1 meta mqabbla ma 'interazzjonijiet segwiti minn simulazzjoni H2B-HLA fuq 100 ns ibbażati fuq is-sit ta' interazzjoni K jew S bejn iż-żewġ peptidi.Kumplessi /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Il-valur tal-limitu għall-evalwazzjoni tal-cross-links ġie stabbilit għal 3.0, u ġew ikkunsidrati interazzjonijiet speċifiċi minn MDS li jieħdu ≥ 10 ns.L-istrutturi tal-proteini ġew viżwalizzati bl-użu ta 'pakketti BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) u Ambjent Operattiv Molekulari (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
L-istabbiltà tal-molekuli HLA-A maż-żmien (devjazzjoni standard; RMSD jew devjazzjoni standard; RMSF) indikat li l-preżenza ta 'proteini H2B jew HMGA1 fil-kumplessi stabbilizzat HLA-A (Figura 8B, Figura S5).Il-proteina HMGA1 torbot sewwa mas-sit B2M ta 'HLA-A, li tinduċi l-istabbiltà tal-aċidi amminiċi HLA-A fil-kumpless HLA-A-HMGA1 jew H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).b'mod partikolari, ir-residwi HLA ~ 60-90 u ~ 180-210 instabu li kienu inqas flessibbli fil-preżenza ta 'H2B (FIG. 8B).H2B u HMGA1 wrew rabta aħjar ma 'HLA-A fil-kumpless H2B-HLA-A-HMGA1 meta mqabbla ma' HLA-A li torbot ma 'H2B jew HMGA1 waħdu (Figura 8C, D; Tabella S5).Residwi involuti fit-twaħħil tal-idroġenu (MD mudellat okkupanza għolja ≥ 10 ns) jikkoinċidu ma 'siti ta' interazzjoni CLMS (residwi K jew S) fil-kumpless, li jissuġġerixxi li l-interazzjonijiet identifikati minn CLMS huma affidabbli ħafna.Affidabilità (Fig. 8E).Fl-immudellar CLMS u MD, ir-residwi HLA-A bejn madwar 190-210 u madwar 200-220 aċidi amminiċi nstabu li jorbtu H2B u HMGA1, rispettivament (FIG. 8E).
L-interazzjonijiet proteina-proteina jiffurmaw netwerks strutturali dinamiċi li jimmedjaw il-komunikazzjoni intraċellulari bi tweġiba għal ċerti stimuli.Minħabba li ħafna approċċi proteomika jiskopru bidliet fil-livell ta 'stat fiss ġenerali ta' proteina, id-dinamika ta 'interazzjoni proteina-proteina teħtieġ għodod addizzjonali biex jaqbdu interfaces li jorbtu, u CLMS hija għodda bħal din.Is-sistema ta 'sinjalazzjoni ta' l-interferon hija netwerk ta 'ċitokini li jippermetti liċ-ċelloli jirrispondu għal firxa ta' sinjali patoġeniċi u patoloġiċi intrinsiċi ambjentali, li jilħqu l-qofol tagħhom fl-induzzjoni ta 'sottogruppi ta' proteini li jinduċu l-interferon.Aħna applikajna CLMS biex niddeterminaw jekk interazzjonijiet ġodda proteina-proteina setgħux jiġu identifikati fost panel ta 'proteini indotti mill-interferon.Analiżi globali tal-cross-linking tal-proteini f'mudell taċ-ċelluli Flo-1 li jirrispondu għall-interferon intużat biex jinqabdu kumplessi ta 'proteini.L-estrazzjoni ta 'peptidi tryptic minn ċelluli mhux cross-linked u cross-linked tippermetti għall-għadd tal-peptidi, arrikkiment tal-mogħdija, u distribuzzjoni tat-tul tal-peptidi b'intensità LFQ definita.Proteini kanoniċi li jinduċu l-interferon ġew identifikati bħala kontroll intern pożittiv, filwaqt li adducts cross-linked intermolekulari u intramolekulari ġodda ta 'proteini kanoniċi li jistgħu jinduċu interferon bħal MX1, UP18, OAS3 u STAT1 ġew osservati.Ġew investigati diversi karatteristiċi strutturali u interazzjonijiet f'oqsma funzjonali.
Interazzjoni bejn HLA-A, MDN1 u H2B ġiet skoperta permezz ta 'immunoblotting fiċ-ċelloli Flo-1 u A549 ittrattati u mhux ittrattati b'IFNα.Ir-riżultati tagħna jenfasizzaw li l-kumplessi HLA-A ma 'H2B b'mod dipendenti fuq IFNα.Ix-xogħol tagħna jirrappreżenta triq interessanti għal aktar esplorazzjoni tal-ko-lokalizzazzjoni ta 'dawn iż-żewġ kumplessi.Ikun interessanti wkoll li jespandi l-approċċ CLMS għal panel ta 'linji ta' ċelluli biex jidentifikaw interazzjonijiet ta 'proteini medjati minn interferon indipendenti mit-tip taċ-ċelluli.Fl-aħħarnett, użajna l-immudellar MD bħala approċċ alternattiv biex nifhmu d-dinamika konformazzjonali tal-proteini involuti fil-kumpless H2BFS-HLA-A-HMGA1, li ssegwi t-taħditiet intramolekulari u intermolekulari.Inferenzi mid-dejta CLMS jissuġġerixxu l-possibbiltà ta 'konformazzjonijiet differenti tal-proteini H2BFS, HLA-A, u HMGA1.Il-konformazzjonijiet differenti possibbli bejn dawn il-kumplessi tal-proteini tad-docking wrew diversi interazzjonijiet simili għal dawk osservati fis-sett tad-dejta CLMS.Waħda mis-saħħiet ewlenin tal-metodu tagħna hija li tippermetti identifikazzjoni faċli ta 'interazzjoni ta' ġeni polimorfiċi ħafna bħall-HLA, għalhekk se jkun interessanti li jiġu studjati l-interazzjonijiet ta 'proteini speċifiċi għall-aplotip HLA li altrimenti huma diffiċli biex jiġu studjati.Meħuda flimkien, id-dejta tagħna turi li CLMS jista 'jintuża biex jespandi l-fehim tagħna ta' netwerks ta 'sinjalazzjoni indotti mill-interferon u jipprovdi bażi għall-istudju ta' sistemi interċellulari aktar kumplessi fil-mikroambjent tat-tumur.
Iċ-ċelluli Flo-1 inkisbu minn ATCC u nżammu f'DMEM (Gibco) supplimentati b'1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% serum bovin tal-fetu (Gibco) u maħżuna f'37 ° C u 5% CO2.Inkubazzjoni.Iċ-ċelloli tkabbru għal 70-80% ta 'konfluwenza qabel ma ġew ittrattati b'IFNα14 (immanifatturat mill-Faċilità ta' Produzzjoni tal-Proteina ta 'Edinburgh).Il-kimiċi u r-reaġenti l-oħra kollha nxtraw mingħand Sigma Aldrich sakemm ma jkunx innutat mod ieħor.
Iċ-ċelloli Flo-1 ġew ikkultivati ​​fi pjanċi ta '6-well u l-jum ta' wara ċ-ċelloli ġew ittrattati b'10 ng/ml IFNα14 għal 24 siegħa sa bejn wieħed u ieħor 80% konfluwenza.Iċ-ċelloli ġew maħsula tliet darbiet b'PBS u ligated b'DSS ippreparat frisk (Thermo Fisher Scientific) (maħlul f'DMSO) f'PBS għal 5 min f'37 ° C. għal konċentrazzjoni finali ta '0.5 mM.Ir-reazzjoni tal-crosslinking tad-DSS ġiet sostitwita b'PBS u DSS residwu ġie mitfi billi żżid 20 mM Tris (pH 8.0) f'PBS għal 15-il minuta f'37 ° C.Iċ-ċelloli nġabru permezz tal-brix u nġabru f'tubi li jorbtu baxxi (Assiġenu).
Il-pellet taċ-ċelluli kien lysed bi 300 µl ta 'l-urea lysis buffer (urea 8 M, 0.1 M Tris, pH 8.5) għal 30 min f'temperatura tal-kamra bi tħawwad okkażjonali.Il-passi kollha taċ-ċentrifugazzjoni saru f'14,000 xg f'8 ° C.Iċċentrifuga l-lisat għal 10 minuti u ttrasferixxi s-supernatant għal tubu ġdid.Il-partiċelli ċari li kien fadal ġew maħlula f'150 μl tat-tieni buffer tal-lisi (2 M urea, 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) għal 30 minuta jew aktar sakemm inkisbet soluzzjoni akwea omoġenja.Il-lisat ġie ċentrifugat għal 20 minuta u s-supernatant tħallat mal-lisat miksub fil-pass preċedenti.Il-konċentrazzjonijiet tal-proteini ġew evalwati bl-użu tal-assaġġ Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur għall-proċeduri tal-mikroplate.Il-kampjuni ġew iffriżati malajr fin-nitroġenu likwidu u maħżuna f'-80 ° C.
Madwar 100 μg ta 'proteina inkroċjata solubbli ġiet ipproċessata bl-użu ta' protokoll ta 'preparazzjoni ta' kampjun ta 'filtrazzjoni modifikat (FASP) kif deskritt minn Wisniewski et al.69 Fil-qosor, il-proteina hija crosslinked ma' 200 µl ta' buffer ta' l-urea (8 M urea f'0.1 M Tris, pH 8.5), imqaxxar b'vortex u mnaqqsa bin-nofs.Il-passi kollha taċ-ċentrifugazzjoni twettqu f'14,000 xg f'25 ° C.L-ewwel nofs tal-lisat tal-proteina cross-linked ġie trasferit għal apparat ta 'filtru ċentrifugali Microcon ta' 10 kDa mgħammar b'membrana Ultracel-10 (Merck), segwit minn ċentrifugazzjoni fuq il-filtru għal 25 minuta.Imbagħad żid it-tieni nofs tal-proteina mal-filtru u rrepeti l-istess passi.L-irkupru tal-proteini sar billi żżid 100 μl ta '17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) fil-buffer tal-urea.L-irkupru tħawwad fuq thermomixer f'600 rpm għal 30 min f'37 ° C.Barra minn hekk, il-kolonna ġiet ċentrifugata u l-proteina cross-linked mnaqqsa ġiet alkilata bl-użu ta '100 μl ta' 50 mM iodoacetamide f'buffer ta 'urea.Ir-reazzjoni ta 'alkilazzjoni twettqet f'temperatura tal-kamra għal 20 minuta fid-dlam.Dawwar il-kolonna, aħsel il-ħitan tal-kolonna 3 darbiet b'100 µl buffer tal-urea, u mbagħad ċentrifuga.L-istess operazzjoni saret 3 darbiet bl-użu ta '100 μl ta' bikarbonat ta 'l-ammonju 100 mM.Qabel it-tripsinizzazzjoni, ibdel it-tubu tal-ġbir b'wieħed ġdid.Żid buffer tad-diġestjoni li jkun fih 50 mM bikarbonat tal-ammonju u 1 µl trypsin dilwit fi trypsin buffer (Promega).Il-proporzjon ta 'trypsin għal proteina nżamm f'madwar 1:33, u r-reazzjonijiet tad-diġestjoni ġew inkubati matul il-lejl f'37 ° C. f'kamra umda.Il-peptide crosslinked ġie eluwit mill-filtru permezz ta' ċentrifugazzjoni għal 25 minuta.L-irkupru tal-peptidi tjieb billi żżid 50 μl ta '0.5 M NaCl mal-filtru, segwit minn ċentrifugazzjoni għal 25 minuta.
Kolonni C18 Micro Spin (Apparat ta 'Harvard) intużaw biex jitneħħew peptidi tryptic cross-linked wara l-protokoll deskritt minn Bouchal et al.70 b'modifiki minuri.Fil-qosor, il-kolonni spin C18 ġew attivati ​​bi tliet ħasliet ta '0.1% aċidu formiku (FA) f'acetonitrile (AcN) (Merck) u żewġ ħasliet ta' 0.1% FA.Il-kolonna ġiet idratata b'0.1% FA għal 15-il minuta.Tagħbija kampjuni f'kolonni spin u aħsel 3 darbiet b'0.1% FA.Il-peptidi desalted ġew elużi b'mod sekwenzjali bi gradjent gradwali bl-użu ta '50%, 80% u 100% AcN f'0.1% FA.Il-kampjuni ġew imnixxfa f'konċentratur SpeedVac Plus (Eppendorf) sakemm il-likwidu residwu sparixxa kompletament.Il-peptidi elużi ġew maħlula f'100 μl ta' 0.08% aċidu trifluworoacetic f'2.5% AcN u l-konċentrazzjonijiet ġew imkejla fuq NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Madwar 1 μg ta 'peptide crosslinked għal kull kampjun ġie injettat fis-sistema LC-MS/MS.
Peptidi cross-linked ġew separati fuq sistema UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) imqabbda ma' spettrometru tal-massa Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Peptidi cross-linked inġabru fuq 300 µm ID, 5 mm twila µ-pre-kolonna C18 qbid kolonna ppakkjata b'sorbent C18 PepMap100 u 5 µm sorbent PepMap (Thermo Scientific).Tagħbija l-fluss tal-pompa ssettjat f'5 µl/min 0.08% aċidu trifluworoaċetiku maħlul f'2.5% AcN.Peptidi cross-linked ġew separati fuq kolonna tas-silika mdewba analitika b'dijametru ta 'ġewwa ta' 75 μm u tul ta '150 mm, mimlija b'sorbent PepMap ta' 2 μm (Thermo Scientific).Il-fażijiet mobbli A u B kienu jikkonsistu f'0.1% FA fl-ilma u 0.1% FA f'acetonitrile, rispettivament.Il-gradjent jibda minn 2.5% B u jiżdied b'mod lineari għal 40% B fuq 90 minuta, imbagħad għal 90% B matul iż-2 minuti li ġejjin.Il-kompożizzjoni tal-fażi mobbli nżammet f'90% B għal 10 minuti u mbagħad naqset b'mod lineari għal 2.5% B fuq 2 minuti.Il-kolonna kienet ekwilibrata f'2.5% B għal 8 minuti qabel iċ-ċiklu li jmiss.Peptidi cross-linked elużi mill-kolonna analitika ġew jonizzati f'sors ta 'jonizzazzjoni nanoelectrospray (NSI) u injettati fi spettrometru tal-massa Exploris 480 (Thermo Scientific).
L-ispettrometru tal-massa Orbitrap Exploris 480 opera fil-mod ta' korrelazzjoni ta' data pożittiva.Sar skan sħiħ fil-modalità ta 'sezzjoni b'riżoluzzjoni ta' 120,000 b'settings ta 'firxa minn m/z 350 Th sa m/z 2000 Th.Il-mira AGC normalizzata ġiet stabbilita għal 300% b'ħin massimu ta 'input ta' 50ms.Ġie stabbilit skoperta tal-quċċata monoisotopika għall-peptidi.Il-parametru tar-rilassament tar-restrizzjoni huwa ssettjat għal veru jekk jinstabu ftit wisq prekursuri.Il-qawwa jonika minima tal-prekursur kienet issettjata għal 5.0e3 u stati ta 'ċarġ tal-prekursur sa + 8 ġew inklużi fl-esperimenti.
Il-ħin taċ-ċiklu bejn skanijiet ewlenin fil-mod ta 'korrelazzjoni tad-dejta kien issettjat għal 2.5 sekondi.L-esklużjoni tal-massa dinamika ġiet issettjata għal 20 s wara l-ewwel frammentazzjoni tal-jone prekursur.It-tieqa tal-iżolament tal-prekursur kienet issettjata għal 2 Th.It-tip ta 'enerġija ta' ħabtiet normalizzata b'mod ta 'enerġija ta' ħabtiet fiss intgħażel fi skan MS/MS dipendenti mid-dejta.Enerġija tal-ħabta stabbilita għal 30%.Ir-riżoluzzjoni Orbitrap kienet stabbilita għal 15,000 u l-mira AGC għal 100%.Il-ħin tal-injezzjoni massimu tad-dwana huwa ssettjat għal 60 millisekondi.
Qabel ma nsegwu n-netwerk tal-proteini-proteini f'kampjuni cross-linked, ipproċessajna l-fajls mhux ipproċessati bl-użu tal-pakkett MaxQuant (verżjoni 1.6.12.0)26,27 biex nidentifikaw peptidi/proteini traċċabbli fil-kampjuni.Barra minn hekk, twettqu analiżi proteomika simili fuq kampjuni Flo-1 mhux inkroċjati ttrattati u mhux ittrattati b'IFNα.Id-dejta tal-MS/MS ġiet imfittxija fid-database tal-bniedem UniProt (www.uniprot.org) (imtella fit-12 ta’ Awwissu 2020, fiha 75,093 daħla) bl-użu tal-magna tat-tiftix integrata Andromeda27.It-tfittxija saret mingħajr ma indikat l-ispeċifiċità ta 'l-enzima u diversi modifiki ta' deamidation (N, Q) u ossidazzjoni (M).It-tolleranzi tal-massa tal-prekursur ġew stabbiliti għal 20 ppm u l-joni tal-prodott f'0.02 Da.Id-devjazzjoni tal-massa inizjali u massima kienet issettjata għal 10 ppm.Il-massa massima tal-peptide ġiet issettjata għal 4600 Da u s-similarità tas-sekwenza ġiet stabbilita bejn 7 u 25 aċidu amminiku (aa).Twettqet aktar analiżi statistika bl-użu tal-programm Perseus (verżjoni 1.6.10.45).Il-kontenut tal-proteina ġie kkalkolat billi tiġi nnormalizzata l-intensità spettrali tal-proteina (intensità LFQ; kwantifikazzjoni mingħajr tikketta)27 u l-valuri tal-intensità ġew konvertiti għal Log2.Raggruppament ġerarkiku ta 'proteini identifikati mill-intensità tal-peptidi tagħhom inbniet bl-użu tal-pakkett pheatmap (v1.0.12) f'R (v 4.1.2).L-analiżi tal-arrikkiment tal-mogħdija saret bl-użu tad-database tal-mogħdija Reactome għal proteini ttrattati b'IFNα li kienu attivati ​​aktar minn erba 'darbiet meta mqabbla ma' kampjuni mhux ittrattati.
L-identifikazzjoni ta 'crosslinks kimiċi speċifiċi ta' lysine (K) jew serine (S) ta 'kumplessi ta' proteini mmonitorjati minn LC-MS/MS saret bl-użu ta 'magna ta' identifikazzjoni spettroskopika (SIM-XL) għal peptidi cross-linked (SIM-XL)29.L-ewwel, l-interazzjonijiet possibbli bejn il-ġeni tal-firma tar-reżistenza għall-ħsara tad-DNA (IRDS) assoċjati mal-interferon (IFN) ġew investigati bl-użu tas-sett tad-dejta tal-proteini IRDS deskritt f'Padariya et al.28.L-iskrinjar tal-kundizzjonijiet u r-repetizzjonijiet kollha tal-UniProt uman kollu huwa komputazzjoni intensiv, għalhekk id-database kollha tal-UniProt tal-bniedem (www.uniprot.org) (imniżżla fit-12 ta' Awwissu 2020, fiha 75,093 daħla) kontra ripetizzjonijiet ittrattati b'IFNα.Wieħed mill-filtri għal interazzjonijiet ta 'fiduċja għolja.Dawn l-interazzjonijiet ta 'sinifikat għoli miksuba ġew estiżi u ttestjati fir-repetizzjonijiet u l-kundizzjonijiet kollha.
F'SIM-XL, DSS intuża għall-crosslinker (XL) u ċ-ċaqliq tal-piż XL u ċ-ċaqliq tal-piż tal-modifika ġew stabbiliti għal 138.06 u 156.07, rispettivament.Is-siti ta' reazzjoni ta' crosslinking li ġejjin huma kkunsidrati: KK, KS u KN-TERM, mingħajr joni reporter.Kemm il-prekursur kif ukoll il-framment ppm ġew issettjati għal 20 u l-limitu Xrea ġie stabbilit għal 0.15.Trypsin kien ikkunsidrat bħala kompletament speċifiku, u ġie implimentat metodu ta 'frammentazzjoni ta' C-trap (HCD) ta 'enerġija għolja.Il-limitu tat-tnaqqis tad-DB dinamiku XCorr u n-numru minimu ta 'peptidi għat-tnaqqis dinamiku tad-DB ġew stabbiliti għal 2.5 u 2, rispettivament.Parametri oħra huma: probabbiltà ta' monoisotopi u cutoff ta' koinċidenza massima, minimu ta' 4 residwi AA għal kull linja u ħlas massimu ta' fergħa, u 3 massimi ta' qsim mitlufa.Il-mapep 2D meħjutin li jirriżultaw ġew analizzati fi (SIM-XL) u r-rappreżentazzjoni grafika xQuest28 intużat biex jinbnew il-mapep 2D.Crosslinks tal-proteini fuq strutturi tal-proteini huma pprovduti f'PyMol (Sistema Grafika Molekulari PyMOL, verżjoni 2.0 Schrödinger, LLC).
L-istrutturi tal-mudell tal-proteini nħolqu bl-użu tas-server Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 bl-użu tal-prinċipji tal-immudellar tal-omoloġija u l-implimentazzjoni tal-"Metodu Markov Moħbi".Phyre2 jiġġenera strutturi mudell ibbażati fuq allinjament ta 'sekwenza ma' strutturi ta 'proteini magħrufa.Għal proteini H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, u MDN1, intużaw strutturi ta 'mudelli 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, u 6i2665.Barra minn hekk, l-istruttura ta 'AlphaFold71 MX1, UBP18 u ROBO1 kienet ikkunsidrata wkoll.L-istruttura tal-proteina ġiet viżwalizzata bl-użu tal-pakkett BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) u l-pakkett tal-Ambjent Operattiv Molekulari (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).