ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tubu Iwweldjat Duplex Għall-komponent kimiku ta 'l-Industrija Kimika, Defiċjenza ta' SPECC1L twassal għal aktar stabbiltà tal-ġonot imqabbla u tnaqqis fil-ħruġ taċ-ċelluli tal-crest newrali kranjali.

Grazzi talli żort Nature.com.Qed tuża verżjoni tal-browser b'appoġġ limitat CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Barra minn hekk, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Tubu Iwweldjat Duplex Għall-Industrija Kimika

Liaocheng Sihe SS Materjal Co., Ltd.hija produttur ewlieni li hija speċjalizzata fil-pajpijiet ta 'l-istainless steel mingħajr saldatura, tubi ittemprati jleqqu, tubi mkessħa mingħajr saldatura eċċ.Sabiex tiffaċilita l-klijenti, għandna pajpijiet iwweldjati u tubi wisq.Liaocheng Sihe SS Materjal Co., Ltd.għandha l-aktar avvanzati li jipproduċu u jittestjaw tagħmir.Nistgħu totalment jissodisfaw il-ħtieġa tiegħek.Skond l-istandard b'mod strett ħafna, tubi li prodotti minna dejjem ikollhom tolleranza korretta OD u WT.Il-kontroll tat-tolleranza huwa strettament konformi biex jipproduċi standards.prodotti tagħna huma dejjem sodisfatti mal-klijenti.Il-klijenti xtraw il-prodotti tagħna ħolqu aktar profitti.
a) OD (Djametru ta 'barra): 3.18mm sa 101.6mm
b) WT (Ħxuna tal-Ħajt): 0.5mm sa 20mm
c) Tul : Skond il-ħtieġa tal-klijent
d) Standards : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 eċċ
e) Metodu tal-Proċess: ERW, EFW eċċ

Sliders li juru tliet artikoli għal kull slide.Uża l-buttuni ta 'wara u li jmiss biex timxi permezz tal-pjastri, jew il-buttuni tal-kontrollur tas-slajds fl-aħħar biex tiċċaqlaq minn kull slide.
Iċ-ċelloli tal-crest newrali kranjali (CNCC) jinżlu mill-jingħalaq newrali embrijoniċi u jemigraw lejn l-arkati farinġi, li jiffurmaw ħafna mill-istrutturi tan-nofs tal-wiċċ.Disfunzjoni CNCC għandha rwol importanti fl-etjoloġija ta 'xquq orofacial, malformazzjoni konġenitali komuni.Mutazzjonijiet eterozigoti SPECC1L instabu f'pazjenti b'xquq atipiċi u sindromiċi.Hawnhekk, nirrapportaw tbajja mtejba ta 'komponenti ta' junction adeżiva kanonika (AJ), β-catenin u E-cadherin f'ċelloli knockdown SPECC1L ikkultivati, u mikrografi elettroniċi juru diffużjoni apikali-bażali ta 'AJ.Biex nifhmu r-rwol ta 'SPECC1L fil-morfoġenesi kranjofacial, ħloqna mudell tal-ġurdien defiċjenti Specc1l.Mutanti omozigoti huma letali embrijoniċi u juru għeluq indebolit tat-tubu newrali u laminazzjoni CNCC.It-tbajja tal-proteina AJ tiżdied f'jingħalaq newrali mutanti.Dan id-difett AJ huwa konsistenti ma 'difett fid-delamination CNCC, li jeħtieġ ix-xoljiment tal-AJ.Barra minn hekk, il-mutanti Specc11 naqqsu s-sinjalar PI3K-AKT u żiedu l-apoptosi.In vitro, inibizzjoni ħafifa tas-sinjalar PI3K-AKT f'ċelluli tat-tip selvaġġ kienet biżżejjed biex tinduċi bidliet fl-AJ.Importanti, il-bidliet AJ indotti minn knockdown ta 'SPECC1L jistgħu jitreġġgħu lura bl-attivazzjoni tal-mogħdija PI3K-AKT.Meħuda flimkien, din id-dejta tissuġġerixxi li SPECC1L, bħala regolatur ġdid tas-sinjalar PI3K-AKT u l-bijoloġija AJ, huwa meħtieġ għall-għeluq tat-tubu newrali u l-istratifikazzjoni CNCC.
Iċ-ċelloli tal-crest newrali kranjali (CNCCs) lokalizzati man-newroectoderm dorsali u jinqalgħu min-newroepiteliju tal-jingħalaq newrali li qed jiżviluppaw permezz ta 'proċess li jinvolvi t-transizzjoni epiteljali-mesenkimali (EMT)1,2,3.CNCCs epiteljali li jemigraw minn qabel ifixklu l-junctions interċellulari u jsiru CNCCs mesenchymal li jemigraw li jimlew l-ewwel u t-tieni arkati farinġi u jiffurmaw il-biċċa l-kbira tal-qarquċa kranjofaċjali.Għalhekk, il-ġeni li jirregolaw il-funzjoni CNCC ħafna drabi huma mfixkla fl-etjoloġija ta 'anomaliji konġenitali kranjowiċċi bħal xquq orofacial, li l-aktar jaffettwaw 1/800 twelid fl-Istati Uniti biss.Waħda mid-deformitajiet konġenitali8.
Id-delaminazzjoni tas-CNC tikkoinċidi mal-għeluq tat-tubu newrali anterjuri bejn 8.5 u 9.5 ijiem ta 'żvilupp embrijoniku fil-ġrieden.Mutanti ta 'numru ta' ġeni assoċjati ma 'xquq orofacial tal-ġurdien juru wkoll xi forma ta' difett fit-tubu newrali, inklużi Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, u Pdgfrα12.Madankollu, il-proċessi tal-għeluq tat-tubu newrali u l-istratifikazzjoni CNCC jistgħu jitqiesu indipendenti, peress li l-ġurdien mutant Splotch (Pax3) juri difetti fl-għeluq tat-tubu newrali mingħajr ebda effett fuq l-istratifikazzjoni jew il-migrazzjoni CNCC 13,14.Mudelli addizzjonali tal-ġurdien b'difetti fid-dissezzjoni CNCC u l-għeluq tat-tubu newrali se jgħinu biex jiddelinejaw il-bażi molekulari komuni ta 'dawn iż-żewġ proċessi.
L-iżolament ta’ CNCC minn ċelluli newroepitelijali jeħtieġ ix-xoljiment ta’ junctions adeżivi (AJs), li huma komposti minn kumplessi ta’ proteini li fihom, fost oħrajn, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, u α-actinin assoċjati ma’ filamenti ta’ actin 2 Studji ta 'espressjoni żejda E-cadherin f'jingħalaq newrali wrew tnaqqis jew dewmien fid-delamination CNCC.Bil-maqlub, is-soppressjoni ta 'E-cadherin tirriżulta fi stratifikazzjoni bikrija15,16.Ħafna mill-fatturi li jimmedjaw l-EMT waqt l-istratifikazzjoni CNCC huma fatturi ta’ traskrizzjoni (AP2α, Id2, FOXD3, SAIL, TWIST, SOX10) u proteini ta’ remodeling tal-matriċi extraċellulari (ECM) bħal matrix metaloproteinases (MMPs), madankollu CNCCs huma regolaturi ċitoskeletali diretti AJ huma għadu mhux magħruf.Il-mogħdija PI3K-AKT hija magħrufa li antagonizza l-livelli tal-E-cadherin, prinċipalment mir-riċerka tal-kanċer17.Studji reċenti wrew li t-telf tas-sinjalar PI3K-AKT ibbażat fuq PDGFα fil-ġrieden iwassal għal anormalitajiet kranjofaċjali, inklużi difetti fil-palat mixquq u tubu newrali12.Madankollu, ir-relazzjoni bejn il-mogħdija PI3K-AKT u l-istabbiltà AJ fuq stratifikazzjoni CNCC mhix ċara.
Preċedentement identifikajna SPECC1L bħala l-ewwel ġene mutant f'żewġ persuni b'qasma severa li testendi mill-ħalq sal-għajn, magħrufa bħala xquq oblikwu (ObFC) jew Tessier IV18 xquq.Mutazzjonijiet SPECC1L ġew identifikati f'żewġ familji multiġenerazzjonali bis-sindromu Opitz G/BBB awtosomali dominanti (OMIM #145410), li fih individwi affettwati wrew distanza eċċessiva u xufftejn/palat mixquq19, u f'familja waħda bis-sindromu ta' distanza eċċessiva Tibi (OMIM #145420)20 .aktar minn nofs il-każijiet tas-sindromu Opitz G/BBB huma X-linked (OMIM #300000) u huma kkawżati minn mutazzjonijiet fil-ġene MID1, li jikkodifika l-proteina 22 tal-iskeletru taċ-ċelluli assoċjati mal-mikrotubuli.Aħna ipoteżi li SPECC1L, ukoll proteina assoċjata mal-mikrotubuli u ċ-ċitoskeletru ta 'l-actin, jista' jimmedja s-sinjalar meħtieġ għal remodeling taċ-ċitoskeletru ta 'l-actin waqt l-adeżjoni taċ-ċelluli u l-migrazzjoni 18 .Permezz ta 'studji in vitro u in vivo, issa niddeskrivu SPECC1L bħala regolatur ġdid tal-istabbiltà tal-AJ permezz tas-sinjalar PI3K-AKT.Fil-livell ċellulari, in-nuqqas ta 'SPECC1L irriżulta fi tnaqqis fil-livell tal-proteina pan-AKT u żieda fid-dispersjoni apikali-bażali ta' AJ, li ġiet eliminata permezz ta 'attivazzjoni kimika tal-mogħdija AKT.In vivo, embrijuni defiċjenti ta 'Spec11 juru għeluq indebolit tat-tubu newrali u dissezzjoni mnaqqsa ta' CNCC.Għalhekk, SPECC1L jiffunzjona f'sinjalazzjoni bbażata fuq l-adeżjoni taċ-ċelluli regolata ħafna meħtieġa għall-funzjoni CNCC normali matul il-morfoġenesi tal-wiċċ.
Biex tikkaratterizza r-rwol ta 'SPECC1L fil-livell ċellulari, użajna l-linja taċ-ċelluli stabbli ta' osteosarkoma deskritta qabel U2OS defiċjenti fl-SPECC1L18.Dawn iċ-ċelluli U2OS stabbli bi knockdown SPECC1L (kd) kellhom tnaqqis moderat (60-70%) fil-livelli ta 'traskrizzjonijiet u proteini SPECC1L, flimkien ma' difetti fil-migrazzjoni u r-riorganizzazzjoni taċ-ċitoskeletru ta 'l-actin 18. B'kuntrast, tnaqqis temporanju sever fil- Intwera li SPECC1L iwassal għal difetti mitotiċi 23 .Wara aktar karatterizzazzjoni, sibna li ċ-ċelloli SPECC1L-kd stabbli tagħna bidlu l-morfoloġija fi grad għoli ħafna ta 'konfluwenza (Figura 1).Ċelloli ta 'kontroll individwali u ċelloli kd f'konfluwenza baxxa dehru simili (Figura 1A, D).24 siegħa wara l-fużjoni, iċ-ċelloli ta 'kontroll żammew il-forma kubojdali tagħhom (Fig. 1B, E), filwaqt li ċ-ċelloli SPECC1L-kd tawwalija (Fig. 1C, F).Il-firxa ta 'din il-bidla fil-forma taċ-ċellula nqabad minn immaġini ħajjin in vivo ta' ċelloli ta 'kontroll u ċelloli kd (film 1).Biex tiddetermina r-rwol ta 'SPECC1L fiċ-ċelloli konfluwenti, l-ewwel eżaminajna l-espressjoni tiegħu.Sibna li l-livelli ta 'proteina SPECC1L żdiedu mal-fużjoni (Figura 1G), filwaqt li l-livelli ta' traskrizzjoni SPECC1L ma żdiedux (Figura 1H).Barra minn hekk, hekk kif żdiedet id-densità taċ-ċelluli, il-proteina SPECC1L akkumulat fil-konfini interċellulari (Fig. 2A-E), b'mudell li jikkoinċidi ma 'dak ta' β-catenin assoċjat mal-membrana (Fig. 2A'-E').Minħabba l-assoċjazzjoni ta 'SPECC1L maċ-ċitoskeletru ta' actin 18,23 aħna ipoteżijna li SPECC1L jinteraġixxi ma 'junctions adeżivi bbażati fuq l-actin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ċelluli tawwalija f'konfluwenza għolja (F) meta mqabbla ma 'ċelluli ta' kontroll U2OS (AC).Hawn huma murija tlieta mis-sitt punti tal-ħin (T1, T3, T6) li għażilna għal densitajiet ta 'ċelluli differenti.(G) Analiżi Western blot li turi li l-proteina SPECC1L hija stabbilizzata fi grad għoli ta 'konfluwenza meta mqabbla ma' grad baxx ta 'konfluwenza fiċ-ċelloli ta' kontroll.Western blot ta 'SPECC1L juri l-faxxa mistennija ta' 120 kDa u faxxa ta 'piż molekulari ogħla, possibbilment modifikata wara t-traduzzjoni (*).Analiżi Western blot saret taħt l-istess kundizzjonijiet għal konfluwenza baxxa u għolja.Stampi li juru SPECC1L f'konfluwenza baxxa u għolja ttieħdu mill-istess blot.L-istess blot tneħħa u eżaminat mill-ġdid b'antikorp β-actin.(H) L-analiżi kwantitattiva RT-PCR ma wriet l-ebda tibdil sinifikanti fil-livelli tat-traskrizzjoni SPECC1L.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw SEMs minn erba' esperimenti indipendenti.
(AE) Għażilna sitt punti ta 'żmien (T1-T6) li jirrappreżentaw firxa ta' densitajiet taċ-ċelluli biex innormalizzaw l-analiżi tal-forma taċ-ċelluli u l-bidliet AJ fiċ-ċelloli U2OS b'knockdown SPECC1L (kd).L-ewwel ħamsa minn dawn il-punti ta 'żmien kienu jinkludu ċelluli singoli (T1), fużjoni ta' 50-70% ta 'clusters ta' ċelluli żgħar (T2), fużjoni mingħajr iffurmar mill-ġdid ta 'ċelluli kd (T3), iffurmar mill-ġdid ta' ċelluli kd (T4), u bidliet ta '24 siegħa.fil-forma ta’ wara ta’ ċelluli kd (T5).Il-proteina SPECC1L kienet imxerrda b'mod predominanti fiċ-ċitoplasma f'T1 (A), iżda l-akkumulazzjoni tagħha kienet osservata fil-konfini interċellulari f'punti ta 'żmien sussegwenti (B-E, vleġeġ).(FJ) β-catenin juri akkumulazzjoni simili fil-konfini interċellulari assoċjati mal-kumpless AJ.(A'-E') SPECC1L u β-catenin juru tbajja li tikkoinċidi fil-fruntieri taċ-ċelluli f'densità għolja taċ-ċelluli (vleġeġ).(F'-J') Fiċ-ċelluli SPECC1L-kd, it-tbajja' ta' β-catenin tidher normali f'densità baxxa taċ-ċelluli (F'-H'), iżda tespandi hekk kif tinbidel il-forma taċ-ċellula (I', J'; vleġeġ), li jindika li AJ inbidlu.Bars = 10 µm.
Imbagħad ippruvajna niddeterminaw l-effett tad-defiċjenza ta 'SPECC1L fuq AJ.Aħna użajna diversi markaturi assoċjati mal-AJ, inklużi l-komponenti kanoniċi F-actin, myosin IIb, β-catenin, u E-cadherin24,25,26,27.Il-fibri tal-istress tal-actin żdiedu fiċ-ċelloli SPECC1L-kd kif deskritt qabel (Fig. 3A, B) 18 .Myosin IIb assoċjati ma 'filamenti ta' actin wera żieda simili fiċ-ċelloli SPECC1L-kd in vitro (Fig. 3C, D).Il-β-catenin assoċjat ma' AJ jeħel ma' cadherin fil-membrana taċ-ċellula, u juri mudell ta' espressjoni ta' "xehda" normali f'kuboċiti ta' kontroll (Fig. 3E, G).Interessanti, f'immaġini ċatti bl-użu ta 'mikroskopija konfokali, it-tbajja' ta' β-catenin (Fig. 3E, F) u E-cadherin (Fig. 3G, H) fuq il-membrana taċ-ċelluli ta 'ċelloli konfluwenti SPECC1L-defiċjenti wrew mudelli prominenti ta' tbajja estiż.Din l-espansjoni ta 'tbajja' β-catenin assoċjata ma' AJ fiċ-ċelluli kd kienet l-aktar evidenti fil-konfluwenza, iżda deher li qabel bidliet fil-forma taċ-ċelluli (Fig. 2F-J, F'-J').Biex tiddetermina n-natura fiżika ta 'din it-tbajja' AJ estiż, eżaminajna l-fruntieri taċ-ċelluli fuq il-wiċċ apikali-bażali taċ-ċelloli SPECC1L-kd U2OS permezz ta' mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni (TEM) (Figura 3I, J).B'kuntrast ma 'ċelloli ta' kontroll (Fig. 3I), li kellhom reġjuni separati densi ta 'elettroni indikattivi ta' AJ (vleġeġ), ċelluli kd (Fig. 3J) wrew reġjuni kbar u kontigwi ta 'densità ta' elettroni għolja indikattiva ta 'AJ tul il-pjan apicobasal..Barra minn hekk, fuq sezzjonijiet trasversali, osservajna jingħalaq estensivi tal-membrana taċ-ċelluli f'ċelloli kd (Fig. S1A, B), li jispjega l-mudell estiż ta 'meded tat-tbajja' ta' β-catenin u E-cadherin (Fig. 3F, H).B'appoġġ għar-rwol ta 'SPECC1L fl-AJs, β-catenin kien ko-immunoprecipitated ma' SPECC1L f'lysates ta 'ċelluli U2OS konfluwenti (Fig. 3K).Flimkien ma 'immunostaining estiż għal markaturi AJ, l-analiżi TEM kienet konsistenti mal-ipoteżi tagħna li d-defiċjenza ta' SPECC1L iżid id-densità u l-varjanza apikali-bażali AJ.
(AH) Żieda fit-tbajja 'F-actin f'ċelluli kd fi 48 siegħa wara l-fużjoni (T6; A, B).Tbajja mibdula ta' myosin IIb assoċjat ma' F-actin (C, D).Il-mudell bla xkiel ta 'tbajja' tal-membrana β-catenin u E-cadherin fiċ-ċelloli ta' kontroll (E, G) kien imsaħħaħ fiċ-ċelloli SPECC1L-kd (F, H).Bars = 10 µm.(I-J) Mikrografi tal-elettroni li josservaw il-junction interċellulari apikali-bażali.Iċ-ċelloli tal-kontroll juru reġjuni distinti densi fl-elettroni li jindikaw junctions li jwaħħlu (I, vleġeġ).B'kuntrast, il-junction apikali-bażali kollha fiċ-ċelloli SPECC1L-kd dehret densa ta 'elettroni (J, vleġeġ), li tindika żieda fid-densità u tixrid ta' junctions adeżivi.(K) β-catenin kien ko-immunoprecipitat ma 'SPECC1L f'lysates taċ-ċelluli U2OS konfluwenti.Immaġni meħuda minn post wieħed li jirrappreżenta wieħed minn erba 'esperimenti indipendenti.
Biex nifhmu r-rwol ta 'SPECC1L fil-morfoġenesi kranjofaċjali, ħloqna mudell tal-ġurdien defiċjenti Specc1l bl-użu ta' żewġ linji taċ-ċelluli ta 'nassa ES indipendenti, DTM096 u RRH048 (BayGenomics, CA), li jirrappreżentaw intron 1 u traskrizzjonijiet Specc1l inqabdu f'15 (Fig. 1) .4A, figura S2).Il-lokazzjoni ġenomika ta 'l-inserzjoni tal-vettur decoy kienet determinata minn sekwenzar tal-ġenoma kollu u kkonfermata mill-PCR (Fig. S2).Iż-żewġ disinji tan-nassa tal-ġeni ppermettew ukoll fużjoni fil-qafas tar-reporters Specc11-lacZ mal-qbid.Għalhekk, l-espressjoni lacZ iddeterminata bit-tbajja 'X-gal intużat bħala indikatur tal-espressjoni Specc11.Iż-żewġ alleli wrew mudelli ta 'espressjoni lacZ simili, bin-nassa tal-ġeni DTM096 fl-intron 1 li turi espressjoni aktar b'saħħitha minn RRH048 fl-intron 15 (mhux murija).Madankollu, Specc1l huwa espress b'mod wiesa ', b'espressjoni partikolarment qawwija fil-jingħalaq newrali f'E8.5 (Figura 4B), fit-tubu newrali u l-proċessi tal-wiċċ f'E9.5 u E10.5 (Figura 4C, D), u fl-iżvilupp tar-riġlejn. f'E10.5 u l-għajnejn (Figura 4D).Preċedentement irrappurtajna li l-espressjoni SPECC1L fl-ewwel arkata farinġali f'E10.5 kienet preżenti fl-epitelju u l-mesenchyme18 sottostanti, konsistenti man-nisel CNCC.Biex tittestja l-espressjoni SPECC1L f'CNC, wettaqna jingħalaq newrali E8.5 (Figura 4E-J) u sezzjonijiet tal-kranju E9.5 (Figura 4K-).F'E8.5, SPECC1L mtebbgħin jingħalaq newrali b'mod intens (Fig. 4E, H), inklużi ċelloli mtebbgħin b'markaturi NCC (Fig. 4G, J).F'E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) imtebba b'mod qawwi CNCC migranti ko-mtebbgħin b'AP2A (Fig. 4L, M) jew SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Rappreżentazzjoni skematika tal-ġene Specc11 tal-ġurdien li turi l-inserzjoni tal-vettur decoy f'kloni taċ-ċelluli ES DTM096 (intron 1) u RRH048 (intron 15).(BD) tbajja lacZ ta 'embrijuni Specc1lDTM096 eterozigoti li jirrappreżentaw l-espressjoni ta' Specc1l minn E8.5 sa E10.5.NE = newroectoderm, NF = tinja newrali, PA1 = l-ewwel arkata farinġi.(EP) SPECC1L immunostaining b'markaturi NCC AP2A u SOX10 f'tinji newrali E8.5 (NF; EJ) u sezzjonijiet tal-kranju E9.5 (KP).It-tbajja 'SPECC1L kienet osservata b'mod wiesa' f'jingħalaq newrali E8.5 (E, H; arrowheads), inklużi ċelloli ttikkettjati b'AP2A (F, G; arrowheads) u SOX10 (I, J; arrowheads).F'E9.5, SPECC1L imtebba b'mod qawwi CNCCs migranti (K, N; vleġeġ) ittikkettjati AP2A (L, M; vleġeġ) u SOX10 (O, P; vleġeġ).
Qsim bejn ġrieden eterozigoti Specc1lDTM096/+ u Specc1lRRH048/+ juri li ż-żewġ alleli tan-nassa tal-ġeni mhumiex komplementari u li eterozigoti komposti u omozigoti embrijoniċi għal kwalunkwe alleli nassa tal-ġeni huma letali embrijoniċi (Tabella S1).Proporzjonijiet Mendelian indikaw tnaqqis fir-rata ta 'sopravivenza ta' eterozigoti mat-twelid (mistennija 1.34 vs 2.0).Aħna nnutaw mortalità perinatali baxxa fost eterozigoti, xi wħud kellhom anomaliji kranjofaċjali (Fig. S3).Madankollu, il-penetranza baxxa ta 'dawn il-fenotipi kraniofacial perinatali tagħmilha diffiċli biex jiġu studjati l-mekkaniżmi patofiżjoloġiċi sottostanti tagħhom.Għalhekk, iffukajna fuq il-fenotip letali embrijoniku ta 'mutanti Specc11 omozigoti.
Ħafna mill-embrijuni mutanti eterozigoti jew omozigoti komposti Specc1lDTM096/RRH048 ma żviluppawx wara E9.5-10.5 (Figuri 5A-D), u t-tubu newrali ma għalaqx minn qabel (Figuri 5B, D) u xi drabi għalaq wara (mhux murija) ..Dan id-difett tal-għeluq tat-tubu newrali kranjali kien assoċjat mal-maġġoranza ta 'DLX2 immarkat CNCC li baqa' fit-tinji newrali f'E10.5, li jindika l-ebda dissezzjoni (Figura 5A'-D').Biex niddeterminaw jekk id-daqs ġenerali tas-CNC tnaqqasx ukoll, aħna ttikkettajna linji CNCC b'GFP fil-linji tagħna ta 'nassa tal-ġeni b'Wnt1-Cre u ROSAmTmG.Aħna stream magħżula GFP+ NCC u GFP- (RFP+) mhux NCC minn embrijuni sħaħ.F'E9.5, il-proporzjon ta 'NCCCs tikkettati bil-GFP magħżula bil-fluss ma nbidilx b'mod sinifikanti bejn WT u embrijuni mutanti (mhux murija), li jindika speċifikazzjoni CNCC normali.Għalhekk, aħna ipoteżijna li t-tbajja residwu ta 'Wnt1-Cre u DLX2 f'jingħalaq newrali esposti (Figura 5B') kienet dovuta għal saffi CNCC difettużi, possibilment minħabba żieda fid-densità jew dispersjoni ta' ċelloli AJ, kif jidher fiċ-ċelloli SPECC1L-kd.Aħna użajna l-markaturi NCC SOX10, AP2A, u DLX2 biex nikkonfermaw il-preżenza ta 'NCC fit-tinja newrali (Figura 5E-R).F'E8.5, it-tbajja tal-tinja newrali għat-tliet markaturi NCC kienet osservata f'sezzjonijiet ta 'WT (Fig. 5E, G, I) u Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).F'E9.5, filwaqt li l-markaturi NCC imtebbgħin NCC migranti f'sezzjonijiet WT (Fig. 5M, O, Q), tbajja NCC residwa kienet osservata f'jingħalaq newrali esposti ta 'embrijuni mutanti Specc1l (Fig. 5N, P, R).Minħabba li SOX10 u DLX2 jimmarkaw CNCCs migranti, dan ir-riżultat jissuġġerixxi li CNCCs defiċjenti ta 'SPECC1L jiksbu speċifikazzjoni ta' wara l-migrazzjoni iżda jonqsu milli jemigraw minn jingħalaq newrali.
Id-defiċjenza ta 'Spec11 twassal għal għeluq difettuż tat-tubu newrali, delamination ta' ċelluli tal-crest newrali kranjali u AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embrijun li jġorr ċelluli tal-crest newrali kranjali (CNCC) immarkati b'Wnt1-Cre (A').B'kuntrast, l-embrijuni mutanti Specc11 juru jingħalaq newrali miftuħa (B), arrowheads) u CNCCs li ma emigrawx (B', arrowheads).(C, D') Immaġini ta 'kamp qawwi (C, D') u immunostaining (C', D') tal-markatur CNCC DLX2 ta' embrijuni E10.5 WT (C, C') u Specc1l (D, D').F'embrijuni WT E10.5, CNCC pożittivi għal DLX2 jikkolonizzaw l-arkati tal-garġi (C', vleġeġ), filwaqt li fil-mutanti, tbajja li tidher tippersisti fil-jingħalaq newrali miftuħa (D', vleġeġ) u fl-ewwel arkati farinġi (D', vleġeġ).) b'xi tbajja '(vleġeġ) li jindikaw delamination fqira u migrazzjoni ta' CNCC.ER) Sezzjonijiet ta 'embrijuni mutanti WT u Specc1l fl-istadji E8.5 (E-L) u E9.5 (M-R) kienu ttikkettjati b'markaturi NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) u DLX2 (I, J, Q, R).F'E8.5, tbajja NCC kienet osservata fit-tinja newrali tat-tip selvaġġ (NF) u sezzjonijiet mutanti.Il-ko-tebgħa ta 'SOX10 u β-catenin f'E8.5 WT (K) u mutant (L) żvelat tebgħa akbar ta' β-catenin fil-konfini taċ-ċelluli fil-jingħalaq newrali.F'E9.5, ġiet osservata tbajja ta 'tip selvaġġ ta' CNCCs migranti (M, O, Q), filwaqt li f'mutanti, CNCCs mhux stratifikati mtebbgħin jingħalaq newrali miftuħa (N, P, R).(S–Z) Analiżi in vivo tat-tikkettar AJ f'sezzjonijiet koronali ta 'embrijuni WT u Specc11DTM096/RRH048 bil-mutazzjoni E9.5.Pjan sezzjonali approssimattiv jidher fir-rokna ta' fuq tal-lemin.F'sezzjonijiet ta' tessuti mutanti, ġiet osservata żieda fit-tbajja ta' F-actin (S, T) u myosin IIb (U, V).Simili għar-riżultati in vitro f'Fig. 3, f'embrijuni mutanti, ġiet osservata tbajja mtejba tal-membrana għal β-catenin (W, X) u E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Mikrografu elettroniku ta 'sezzjoni ta' embrijun ta 'tip selvaġġ li jħares lil hinn mill-fruntiera taċ-ċellula apikali-bażali juri reġjun distint ta' dens ta 'elettroni indikattiv ta' junctions adeżivi (AA, vleġeġ).B'kuntrast, f'sezzjonijiet ta 'embrijuni mutanti Specc11 (BB, vleġeġ), il-junction apikobażali kollha hija densa ta' elettroni, li tindika densità akbar u dispersjoni ta 'junctions adeżivi.
Biex tittestja l-ipoteżi tagħna li saffi mnaqqsa hija dovuta għal AJ mibdula, eżaminajna l-ittikkettjar AJ f'jingħalaq newrali esposti ta 'embrijuni mutanti Specc1l (Fig. 5S-Z).Aħna osservajna żieda fil-fibri ta 'stress ta' l-actin (Fig. 5S, T) u lokalizzazzjoni miżjuda konkomitanti ta 'tbajja' myosin IIB fuq fibri ta' actin (Fig. 5U, V).Importanti, osservajna żieda fit-tbajja ta 'β-catenin (Fig. 5W, X) u E-cadherin (Fig. 5Y, Z) fil-konfini interċellulari.Aħna eżaminajna wkoll it-tbajja ta 'β-catenin ta' NCC fil-jingħalaq newrali ta 'embrijuni E8.5 (Fig. 5K, L).It-tbajja' ta' β-catenin deher li kien aktar b'saħħtu f'tinji newrali mutanti Specc1l (Fig. 5L u K), li jissuġġerixxi li l-bidliet AJ kienu bdew.Fil-mikrografiji elettroniċi ta 'sezzjonijiet tal-kranju ta' embrijuni E9.5, aħna għal darb'oħra osservajna żieda fit-tbajja' densa ta 'elettroni mxerrda f'embrijuni mutanti Specc1l meta mqabbla ma' WT (Fig. 5AA, BB u S1E-H).Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jappoġġjaw ir-riżultati in vitro tagħna fiċ-ċelloli SPECC1L-kd U2OS u jissuġġerixxu li t-tbajja aberranti ta 'AJ tippreċedi l-istratifikazzjoni CNCC fl-embrijuni mutanti tagħna.
Minħabba r-relazzjoni antagonistika magħrufa bejn l-attività tal-AKT u l-istabbiltà tal-E-cadherin, 17,28 ipotizzajna l-involviment tas-sinjalar PI3K-AKT.Barra minn hekk, osservajna nfafet subepidermali f'xi wħud mill-embrijuni mutanti tagħna li ħarbu mil-letalità (<5%) f'E9.5-10.5 u minflok issetiljaw madwar E13.5 (Fig. S3).Il-vesikoli sottoepidermali huma karatteristika ta' sinjalar PI3K-AKT imnaqqas ibbażat fuq PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) irrappurtaw li t-tfixkil tal-attivazzjoni tal-PI3K ibbażata fuq PDGFRα f'embrijuni mutanti PdgfraPI3K/PI3K jirriżulta f'vesikuli subepidermali, difetti fit-tubi newrali, u fenotipi tal-palat mixquq.Tabilħaqq, livelli ta 'pan-AKT u ser473-AKT fosforilati attiv tnaqqsu in vivo f'tessuti mutanti Specc1l għal arrest embrijoniku E9.5 (Fig. 6A-D).It-tnaqqis fil-livelli ta 'Ser473-AKT fosforilati jista' jkun kompletament minħabba t-tnaqqis fil-livelli ta 'pan-AKT in vivo (FIG. 6E) u in vitro (FIG. 6F).Tnaqqis in vitro kien osservat biss meta ċ-ċelloli U2OS kienu konfluwenti b'mod qawwi ma 'bidliet fil-forma taċ-ċelluli u d-densità AJ (Figura 6D).Għalhekk, id-dejta tagħna tissuġġerixxi li SPECC1L huwa regolatur pożittiv ġdid tas-sinjalar PI3K-AKT fil-morfoġenesi kranjofaċjali.
(A–E) Sezzjonijiet tal-kranju E8.5 (A,B) u E9.5 (C,D) jew lisati E9.5 minn embrijuni mutanti Specc1l (E) li juru livelli ta’ S473-AKT fosforilati attivi u tnaqqis tal-proteini pan-AKT , meta mqabbla mal-kontroll WT.Western blotting sar fuq lisati tat-tip selvaġġ u lisati mutanti taħt l-istess kundizzjonijiet.L-immaġini murija għal SPECC1L ittieħdu minn blot wieħed.L-istess blot tneħħiet u reġgħet ġiet eżaminata b'antikorpi anti-pan-ACT u β-actin.Livelli ta 'Pan-AKT f'tinji newrali E8.5 (A, B) u livelli ta' S473-AKT fosforilati f'sezzjonijiet tal-kranju E9.5 tnaqqsu b'mod sinifikanti.(F) Il-livelli ta 'Pan-AKT tnaqqsu bl-istess mod f'lysates ta' ċelloli SPECC1L-kd U2OS maħsuda f'konfluwenza għolja.Il-vireg tal-iżbalji jirrappreżentaw SEMs minn tliet kwantifikazzjonijiet Western blot indipendenti.(GJ) Sezzjonijiet ta 'embrijuni WT f'E9.5 mtebbgħin b'KI67 u qasmu caspase 3, rispettivament, li juru proliferazzjoni taċ-ċelluli (G, G') u attività apoptotika ftit (H, H').L-embrijuni mutanti Specc11 juru proliferazzjoni taċ-ċelluli komparabbli (I), iżda n-numru ta 'ċelluli li għaddejjin minn apoptożi jiżdied b'mod sinifikanti (J).
Imbagħad eżaminajna markaturi ta 'proliferazzjoni u apoptożi.Aħna ma osservajna l-ebda differenza fil-proliferazzjoni ta 'embrijuni E9.5 (Fig. 6E, G meta mqabbel ma' I) b'indiċi ta 'proliferazzjoni ta' 82.5% għal mutanti WT u 86.5% għal mutanti Specc1l imkejla permezz ta 'tbajja' KI67 (p <0.56, Fisher's test eżatt).Bl-istess mod, aħna ma osservajna l-ebda differenza fl-apoptożi mkejla permezz ta 'tbajja' għal caspase cleaved 3 fi jingħalaq newrali f'E8.5 sal-arrest tal-embrijuni (mhux murija) (mhux murija).B'kuntrast, l-apoptosi żdiedet b'mod sinifikanti fl-embrijuni mutanti E9.5 kollha (Fig. 6F, H u J).Din iż-żieda ġenerali fl-apoptosi hija konsistenti ma 'sinjalazzjoni PI3K-AKT mnaqqsa u letalità embrijonika bikrija29,30,31.
Sussegwentement, biex tikkonferma rwol kawżali għas-sinjalar PI3K-AKT f'bidliet AJ fiċ-ċelluli kd tagħna, biddilna kimikament il-mogħdija fiċ-ċelloli tal-kontroll u kd (Figura 7A-F).Aħna użajna bħala markatur il-fenotip tal-bidla fil-forma taċ-ċellula osservat f'ċelloli SPECC1L-kd konfluwenti, li kkwantifikajna bl-użu tal-proporzjon tal-itwal dimensjoni (tul) mad-dimensjoni vertikali korrispondenti (wisa ').Proporzjon ta '1 huwa mistenni għal ċelluli relattivament tondi jew kubojdali (Figura 7G).Minbarra l-forma taċ-ċelluli, aħna kkonfermajna wkoll l-effett fuq AJ permezz ta 'tbajja' β-catenin (Fig. 7A'-F').L-inibizzjoni tal-mogħdija PI3K-AKT bl-użu ta 'wortmannin kienet biżżejjed biex tibdel il-forma taċ-ċelluli fiċ-ċelloli ta' kontroll (Figura 7A, C) u AJ (Figura 7A').L-attivatur PI3K-AKT SC-79 ma affettwax il-forma taċ-ċellula (FIG. 7A, E) jew espansjoni AJ (FIG. 7A') fiċ-ċelloli tal-kontroll.Fiċ-ċelloli SPECC1L-kd, aktar soppressjoni tal-mogħdija PI3K-AKT irriżulta f'żieda fl-apoptożi (Fig. 7B, D) u żieda notevoli fit-tbajja 'ta' β-catenin (Fig. 7B '), konsistenti mal-mutanti tqal tagħna in vivo.Importanti, l-attivazzjoni tal-mogħdija PI3K-AKT tejbet b'mod sinifikanti l-forma taċ-ċelluli (Figura 7B, F) u l-fenotipi AJ (Figura 7B").Bidliet fil-forma taċ-ċelluli ġew ikkwantifikati bħala proporzjon tat-tond taċ-ċelluli (CCR) u mqabbla għas-sinifikat kif deskritt hawn fuq (FIG. 7G).Tabilħaqq, fiċ-ċelloli ta 'kontroll (Fig. 7G, CCR = 1.56), it-trattament ta' wortmannin kien biżżejjed biex jibdel b'mod sinifikanti l-forma taċ-ċellula (Fig. 7G, CCR = 3.61, p < 2.4 × 10-9) sal-punt simili għal dak osservat fi SPECC1L.-kd ċelluli (Fig. 7G, CCR = 3.46).Trattament Wortmannin ta 'ċelluli SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, negliġibbli) ma kienx aktar sinifikanti minn ċelluli kd mhux ittrattati (Fig. 7G, CCR = 3.46, negliġibbli) jew ċelluli ta' kontroll ittrattati wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3.46, negliġibbli) taffettwa wkoll it-titwil taċ-ċelluli (7G, CCR = 3.61, negliġibbli).L-aktar importanti, l-attivatur SC-79 AKT irrestawra l-fenotip tawwali taċ-ċelloli SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1.74, p < 6.2 × 10-12).Dawn ir-riżultati jikkonfermaw li SPECC1L jirregola s-sinjalar PI3K-AKT u jissuġġerixxu li tnaqqis moderat fl-SPECC1L jaffettwa l-adeżjoni taċ-ċelluli, filwaqt li tnaqqis qawwi jwassal għal apoptożi (Fig. 8).
(A–F') Kontroll (A, C, E) u ċelluli SPECC1L-kd (B, D, F) ittrattati b'inibitur tal-mogħdija PI3K-AKT wortmannin (C, D) jew attivatur SC-79 (E, F) Trattament .Ċelloli ta 'kontroll mhux ittrattati huma kubojdali (A) bi tbajja' normali β-qattus (A'), filwaqt li ċ-ċelluli kd huma tawwalija (B) b'żieda ta' tebgħa β-qattus (B').Wara s-soppressjoni tal-mogħdija PI3K-AKT, iċ-ċelluli ta 'kontroll tawwalija (C) b'espansjoni β-qattus (C'), filwaqt li ċ-ċelloli kd bdew jgħaddu minn apoptożi (D), simili għall-embrijuni mutati ħafna tagħna u li juru β-qattus estremament mtejba.tbajja’ (D’).Wara l-attivazzjoni tal-mogħdija PI3K-AKT, iċ-ċelluli ta 'kontroll baqgħu kubojdali (E) u kellhom tbajja normali β-qattus (E'), filwaqt li ċ-ċelluli kd wrew forma taċ-ċelluli mtejba b'mod sinifikanti (F) u tbajja' β-qattus (F'), li jindikaw (G) Il-grad ta 'bidla fil-forma taċ-ċellula f'(AF) ġie kkwantifikat bl-użu tal-proporzjon tat-tond taċ-ċellula (CCR) tal-itwal dimensjoni (tul) u d-dimensjoni vertikali korrispondenti (wisa') bl-użu ta 'softwer MetaMorph.Ċelloli SPECC1L-kd mhux ittrattati (NT) (CCR = 3.46) kienu sinifikament itwal minn ċelluli ta 'kontroll (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).L-inibizzjoni tal-wort tal-mogħdija PI3K-AKT fiċ-ċelloli tal-kontroll kienet biżżejjed biex tikkawża elongazzjoni simili fil-forma taċ-ċellula (CCR=3.61, p<2.4 × 10-9).Bl-istess mod, l-attivazzjoni ta 'AKT minn SC-79 fiċ-ċelloli SPECC1L-kd restawrat it-titwil taċ-ċelluli għal livelli ta' kontroll (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).It-trattament ta 'Wortmannin taċ-ċelloli SPECC1L-kd irriżulta f'żieda fl-apoptożi iżda l-ebda żieda ulterjuri fil-bidla fil-forma taċ-ċelluli (CCR=3.60) meta mqabbla ma' kd mhux ittrattati (CCR=3.46, ns) jew ċelluli ta 'kontroll ittrattati b'wortmannin (3.61) osservati f'.ns = ma jimpurtax.Jintwera kejl +/- SEM għal 50 ċellula.Id-differenzi statistiċi ġew ikkalkulati bl-użu tat-test t ta' Student.
(A) Rappreżentazzjoni skematika ta 'inibizzjoni u attivazzjoni tal-mogħdija PI3K-AKT li tirriżulta f'bidliet AJ u salvataġġ, rispettivament.(B) Mudell propost għall-istabbilizzazzjoni tal-proteina AKT minn SPECC1L.
CNCCs premigratorji jeħtieġu liżi AJ biex tissepara miċ-ċelluli newroepitelijali ta 'jinja newrali ta' quddiem1,15,32.Żieda fit-tbajja’ tal-komponenti AJ u telf tad-distribuzzjoni asimmetrika tal-AJ apikali-bażali f’ċelloli defiċjenti ta’ SPECC1L kemm in vitro kif ukoll in vivo, flimkien mal-prossimità fiżika ta’ SPECC1L għal β-catenin, jissuġġerixxu li SPECC1L jiffunzjona biex iżomm sew l-istabbiltà lokali tal-AJ għal muskoli organizzazzjoni.ċitoskeletru ta' l-actin.L-assoċjazzjoni ta 'SPECC1L maċ-ċitoskeletru ta' actin u β-catenin u ż-żieda fin-numru ta 'filamenti ta' actin ikkondensati fin-nuqqas ta 'SPECC1L hija konsistenti maż-żieda osservata fid-densità AJ.Possibbiltà oħra hija li numru akbar ta 'fibri actin fiċ-ċelloli defiċjenti ta' SPECC1L iwassal għal bidla fit-tensjoni interċellulari.Minħabba li l-istress ċellulari jaffettwa d-dinamika ta 'AJ 33, il-bidliet fil-vultaġġ jistgħu jirriżultaw f'AJ 34 aktar diffuż.Allura kwalunkwe tibdil se jaffettwa s-saffi CNCC.
Wnt1 huwa espress fit-tinji newrali bikrija li jagħtu lok għal ċelloli tal-crest newrali.Għalhekk, it-traċċar tan-nisel Wnt1-cre jimmarka kemm NCC35 qabel kif ukoll il-migrazzjoni.Madankollu, Wnt1 jimmarka wkoll kloni tat-tessut tal-moħħ dorsali derivati ​​wkoll minn jingħalaq newrali bikrija 35,36, li jagħmilha probabbli li t-tbajja tagħna ta 'mutanti E9.5 għal markaturi Wnt1 f'jingħalaq newrali miftuħa mhix CNCC.It-tbajja pożittiva tagħna għall-markaturi NCC AP2A u SOX10 ikkonfermat li l-jingħalaq newrali esposti tal-embrijuni mutanti Specc11 tabilħaqq kien fihom CNCC.Barra minn hekk, peress li AP2A u SOX10 huma markaturi ta 'NCC ta' migrazzjoni bikrija, tbajja pożittiva indikat li dawn iċ-ċelloli huma CNCC ta 'wara l-migrazzjoni li ma jistgħux jiġu stratifikati minn E9.5.
Id-dejta tagħna tissuġġerixxi li r-regolamentazzjoni molekulari ta 'AJ minn SPECC1L hija medjata minn sinjalazzjoni PI3K-AKT.Is-sinjalar AKT huwa mnaqqas f'ċelloli u tessuti defiċjenti SPECC1L.Sejbiet minn Fantauzzo et al.jappoġġjaw rwol dirett għas-sinjalar PI3K-AKT fil-morfoġenesi kranjofaċjali.(2014) wera li n-nuqqas ta 'attivazzjoni ta' sinjalazzjoni PI3K-AKT ibbażata fuq PDGFRα twassal għal fenotip tal-palat mixquq.Aħna nuru wkoll li l-inibizzjoni tal-mogħdija PI3K-AKT hija biżżejjed biex tibdel l-AJ u l-forma taċ-ċelluli fiċ-ċelloli U2OS.Konsistenti mas-sejbiet tagħna, Cain et al.37 wera li r-regolazzjoni 'l isfel tas-subunità PI3K α110 fiċ-ċelloli endoteljali tirriżulta f'żieda simili fit-tbajja' periċellulari ta' β-catenin, imsejħa żieda fl-"indiċi tal-konnettività".Madankollu, fiċ-ċelloli endoteljali li l-filamenti ta 'l-actin tagħhom huma diġà organizzati ħafna, is-soppressjoni tal-mogħdija PI3K-AKT tirriżulta f'forma ta' ċellula laxka.B'kuntrast, iċ-ċelloli SPECC1L-kd U2OS wrew forma ta 'ċellula tawwalija.Din id-differenza tista' tkun speċifika għat-tip taċ-ċellula.Filwaqt li s-soppressjoni tas-sinjalar PI3K-AKT taffettwa b'mod permanenti ċ-ċitoskeletru tal-actin, l-effett fuq il-forma taċ-ċellula huwa ddeterminat minn bidliet fit-tensjoni kkawżati minn bidliet fid-densità u l-organizzazzjoni tal-fibri tal-actin ċentrali.Fiċ-ċelloli U2OS, użajna biss bidliet fil-forma taċ-ċelluli bħala markatur tal-bidla u l-irkupru tal-AJ defiċjenti minn SPECC1L.Bħala konklużjoni, aħna ipoteżi li l-inibizzjoni tal-mogħdija AKT f'defiċjenza SPECC1L żżid l-istabbiltà AJ u tnaqqas id-delaminazzjoni f'CNC.
Interessanti, il-livelli pan-AKT tnaqqsu in vitro u in vivo minbarra l-livelli fosforilati ta '473-AKT fin-nuqqas ta' SPECC1L, li jissuġġerixxi regolamentazzjoni tas-sinjalar PI3K-AKT fil-livell ta 'stabbiltà jew fatturat tal-proteini AKT.Il-ġeni SPECC1L u MID1, it-tnejn assoċjati mas-sindromu Opitz/GBBB, jikkodifikaw proteini li jistabbilizzaw il-mikrotubuli 18,22.Il-mekkaniżmu li bih SPECC1L u MID1 jimmedjaw l-istabbilizzazzjoni tal-mikrotubuli mhuwiex mifhum bis-sħiħ.Fil-każ ta 'SPECC1L, din l-istabbilizzazzjoni tinkludi aċetilazzjoni msaħħa ta' subsett ta 'mikrotubuli 18 .Huwa possibbli li SPECC1L juża mekkaniżmu simili biex jistabbilizza proteini oħra bħal AKT.Intwera li l-aċetilazzjoni tar-residwi tal-lisina fil-proteina AKT twassal għal tnaqqis fil-lokalizzazzjoni tal-membrana u l-fosforilazzjoni38.Barra minn hekk, l-ubiquitination tal-katina K63 fl-istess residwu tal-lisina fuq AKT hija meħtieġa għall-lokalizzazzjoni u l-attivazzjoni tal-membrana tagħha39,40.Fost diversi fatturi li jinteraġixxu mal-proteini SPECC1L identifikati f'diversi skrins ta 'żewġ ibridi tal-ħmira ta' throughput għoli, erbgħa - CCDC841, ECM2942, APC u UBE2I43 - ġew implikati fil-fatturat tal-proteini jew l-istabbiltà permezz ta 'ubiquitination jew sumoylation.SPECC1L jista 'jkun involut f'modifika ta' wara t-traduzzjoni tar-residwi tal-lisina AKT, li jaffettwa l-istabbiltà tal-AKT.Madankollu, ir-rwol kritiku ta 'SPECC1L fil-lokalizzazzjoni u l-istabbiltà tal-proteina AKT għad irid jiġi eluċidat.
Difetti severi fl-espressjoni ta 'SPECC1L in vivo rriżultaw f'żieda ta' tbajja tal-markatur AJ u overlay CNCC difettuż, kif ukoll żieda fl-apoptożi u letalità embrijonika bikrija.Rapporti preċedenti wrew li mutanti tal-ġrieden b'livelli miżjuda ta 'apoptożi huma assoċjati ma' difetti fit-tubu newrali 44,45,46,47 u difetti kranjofaċjali48.Ġie ssuġġerit li l-mewt taċ-ċelluli eċċessiva fil-jingħalaq newrali jew l-arkati farinġi tista 'tirriżulta f'numru insuffiċjenti ta' ċelloli meħtieġa għal moviment morfoġenetiku xieraq 48,49,50.B'kuntrast, il-linji taċ-ċelluli defiċjenti SPECC1L tagħna b'espressjoni SPECC1L moderatament imnaqqsa wrew biss bidliet AJ mingħajr evidenza ta 'żieda fil-mewt taċ-ċelluli.Madankollu, l-inibizzjoni kimika tal-mogħdija PI3K-AKT f'dawn iċ-ċelloli Kd irriżulta f'żieda fl-apoptożi.Għalhekk, tnaqqis moderat fl-espressjoni jew il-funzjoni SPECC1L jiżgura sopravivenza taċ-ċelluli.Dan huwa konsistenti mal-osservazzjoni li embrijuni mutanti Specc11 rari li jaħarbu mill-arrest f'st.E9.5—forsi minħabba tnaqqis fl-effiċjenza tal-qbid tal-ġeni—jistgħu jagħlqu t-tubi newrali tagħhom u jieqfu aktar tard fl-iżvilupp, ħafna drabi b'difetti kranjofaċjali (Fig. S3).Konsistenti ma’ dan hija wkoll l-okkorrenza rari ta’ embrijuni Specc1l eterozigoti b’anormalitajiet kranjofaċjali—probabbilment minħabba żieda fl-effiċjenza tal-qbid tal-ġeni—kif ukoll is-sejba f’zebrafish fejn wieħed miż-żewġ ortologi SPECC1L (specc1lb) jikkawża fenotipi embrijoniċi tard, inkluż telf ta’ xedaq t'isfel u xquq bilaterali51.Għalhekk, mutazzjonijiet eterozigoti ta 'telf ta' funzjoni SPECC1L identifikati f'pazjenti umani jistgħu jikkawżaw indebolimenti żgħar fil-funzjoni SPECC1L matul il-morfoġenesi kranjofaċjali, biżżejjed biex jispjegaw il-qsim orofacial tagħhom.Ir-regolamentazzjoni bbażata fuq SPECC1L tal-kuntatti interċellulari jista 'wkoll ikollha rwol fil-palatoġenesi u l-fużjoni tal-arkati farinġi.Studji ulterjuri tal-funzjoni SPECC1L se jgħinu biex jiċċaraw ir-rwol ta 'kuntatti interċellulari temporanji f'CNC waqt l-għeluq tat-tubu newrali fil-motilità taċ-ċelluli newroepiteliali u l-morfoġenesi kranjofaċjali.
Il-kontroll tal-osteosarkoma U2OS u ċ-ċelloli SPECC1L-kd ġew deskritti qabel (Saadi et al., 2011).Antikorpi kontra SPECC1L ġew ikkaratterizzati wkoll qabel (Saadi et al., 2011).Antikorpi anti-β-catenin (fenek; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (ġurdien; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), qasma caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) u β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) intuża kif deskritt..Filamenti ta 'l-actin kienu mtebbgħin b'Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Iċ-ċelloli tal-kontroll U2OS u ċ-ċelloli SPECC1L-kd ġew ikkultivati ​​f'DMEM standard ta 'glukożju għoli supplimentat b'10% serum bovin fetali (Life Technologies, Carlsbad, CA).Għal bidliet AJ, 2 x 105 ċelluli ġew miżrugħa fuq ħġieġ ittrattat b'0.1% ġelatina porċina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u osservati għal bidliet fil-forma taċ-ċelluli.Iċ-ċelloli nġabru f'punti ta 'ħin indikati differenti: 4 sigħat wara ż-żrigħ (t = 1), 24 siegħa wara ż-żrigħ (t = 2), konfluwenza mingħajr bidla fil-forma taċ-ċellula (t = 3), bidla fil-forma taċ-ċellula (t = 4) , 24 siegħa wara l-bidla fil-forma taċ-ċellula (t = 5) u 48 siegħa wara l-bidla fil-forma taċ-ċellula (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Biex jimmodulaw il-mogħdija PI3K-AKT, iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​fil-konċentrazzjonijiet indikati bl-inibitur PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) jew attivatur SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Il-mezz li kien fih is-sustanzi kimiċi kien mibdul kuljum.
Saru reġistrazzjonijiet qafas b'qafas fuq kontroll ħajjin u ċelloli KD taħt kundizzjonijiet ta 'kultura normali, u immaġni ta' kuntrast ta 'fażi nġabru kull 10 minuti għal 7 ijiem.L-immaġini ġew akkwistati permezz ta 'mikroskopju invertit Leica DM IRB ikkontrollat ​​bil-kompjuter mgħammar bi stadju mekkaniku u objettiv 10 × N-PLAN konness ma' kamera QImaging Retiga-SRV.Matul l-immaġini, il-kulturi taċ-ċelluli nżammu f'37 ° C f'atmosfera umda b'5% CO2.
Żewġ linji taċ-ċelluli ES ta 'nassa tal-ġeni DTM096 u RRH048 miċ-Ċentru Reġjonali tar-Riżorsi tal-Ġurdien Mutant (UC Davis, CA) intużaw biex jiġġeneraw linji tal-ġurdien defiċjenti Specc11, nominati Specc1lgtDTM096 u Specc1lgtRRH046.Fil-qosor, ċelluli 129/REJ ES ġew injettati f'blastocisti C57BL6.Il-ġrieden maskili kimeriċi li rriżultaw ġew imrobbija ma 'ġrieden C57BL6 nisa biex jidentifikaw il-frieħ bil-kulur tal-kisja agouti.Il-preżenza ta 'inserts tal-vettur tan-nassa tal-ġeni ntużat biex jiġu identifikati eterozigoti.Il-ġrieden inżammu fuq sfond imħallat ta' 129/REJ;C57BL6.Il-post tas-sit ta 'inserzjoni tal-vettur tan-nassa ġenetika ġie kkonfermat minn RT-PCR, sekwenzar tal-ġenoma, u komplementazzjoni ġenetika (Figura 1 Supplimentari).Biex tiġi rintraċċata n-nisel CNCC ta 'ġrieden Specc1lGT eterozigoti doppji, ġrieden ROSAmTmG (# 007576) u Wnt1-Cre (# 003829) (Laboratorju Jackson, Bar Harbor, ME) ġew qasmu biex jipproduċu l-allele ROSAmTmG u Wnt1-Cre f'e Speccryos mutant.L-esperimenti kollha fil-ġrieden saru skont protokolli approvati mill-Kumitat Istituzzjonali għall-Kura u l-Użu tal-Annimali taċ-Ċentru Mediku tal-Università ta 'Kansas.
L-embrijuni ġew iffissati f'(1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) għal 60 min f'temperatura tal-kamra.Wara l-iffissar f'soluzzjoni tat-tbajja 'X-gal (5 mM ferricyanide tal-potassju, 5 mM ferrocyanide tal-potassju, 2 mM MgCl2, 0.01% deoxycholate tas-sodju, 0.02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) L-iżvilupp tat-tbajja' sar f'37°C .°C fi żmien 1-6 sigħat.L-embrijuni ġew iffissati wara f'4% PFA u viżwalizzati.
Għal Western blotting, iċ-ċelloli ġew lysed f'buffer passiv lysis (Promega, Fitchburg, WI) supplimentat b'taħlita ta 'inibituri tal-protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysates ġew ipproċessati fuq 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX ġellijiet lesti (Bio-Rad, Hercules, CA) u trasferiti għal membrani Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Il-membrani ġew imblukkati f'5% ħalib f'PBS li kien fih 0.1% Tween.L-antikorpi ġew inkubati matul il-lejl f'4 ° C jew għal siegħa f'temperatura tal-kamra.Ir-reaġent Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) intuża għall-ġenerazzjoni tas-sinjali.Għall-immunostaining, l-embrijuni ġew iffissati matul il-lejl f'4% PFA/PBS u krijopreservati.Cryosections tat-tessuti ġew imblukkati f'PBS li kien fih 1% serum normali tal-mogħoż (Thermo Scientific, Waltham, MA) u 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) u mbagħad inkubati f'4°C f'inkubatur matul il- lejl.b'anti-antikorp u antikorp sekondarju fluworexxenti (1:1000) għal siegħa f'4°C.Sezzjonijiet imtebbgħin tqiegħdu f'medja tad-deheb ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) u immaġni ċatti nkisbu bl-użu ta 'mikroskopju konfokali Leica TCS SPE.Kull immunostaining twettqet bħala tliet esperimenti indipendenti fuq ċirossezzjonijiet ta 'mill-inqas żewġ embrijuni mutanti.Jintwera esperiment rappreżentattiv.
Iċ-ċelloli ġew inkubati f'buffer RIPA modifikat (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliċerol, 2 mM EDTA, u inibitur tal-protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Fil-qosor, lisati ġew ippurifikati minn qabel bi żibeġ manjetiċi tal-proteina G (Life Technologies, Carlsbad, CA) u mbagħad inkubati matul il-lejl f'4 ° C. b'żibeġ tal-proteina G anti-SPECC1L jew IgG intużaw biex jiġu estratti SPECC1L u Western blotting sar bl-użu tal-anti -β-catenin antikorp deskritt hawn fuq L-esperimenti ko-IP murija huma rappreżentattivi ta 'erba' esperimenti indipendenti.
Ċelloli kkultivati ​​fissi jew tessuti embrijoniċi tal-ġurdien ġew ipprovduti liċ-ċentru tal-mikroskopija elettronika fiċ-Ċentru Mediku tal-Università ta 'Kansas.Fil-qosor, il-kampjuni ġew inkorporati fir-reżina EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimerizzati matul il-lejl f'60 ° C, u ssezzjonati f'80 nm bl-użu ta 'ultramicrotome Leica UC7 mgħammar b'xafra tad-djamant.Is-sezzjonijiet ġew viżwalizzati bl-użu ta 'mikroskopju elettroniku ta' trażmissjoni JEOL JEM-1400 mgħammar b'kanun Lab6 ta '100 kV.
Kif tikkwota dan l-artikolu: Wilson, NR et al.Id-defiċjenza ta 'SPECC1L twassal għal aktar stabbiltà tal-ġonot spliced ​​u mnaqqsa tad-delaminazzjoni taċ-ċelloli tal-crest newrali kranjali.ix-xjenza.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induzzjoni u differenzjazzjoni tal-crest newrali.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Ċelloli tal-crest newrali kranjali fil-moviment: ir-rwol tagħhom fl-iżvilupp kranjofacial.Ġurnal Amerikan tal-Ġenetika Medika.Parti A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: it-tkabbir u l-iżvilupp tiegħu fuq 20 sena.Pedjatra.patoloġija.laboratorju.mediċina.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU u Noten MM Breakthrough fil-ġenetika ta 'xquq orofacial.Xejriet fil-Mediċina Molekulari 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. u Riley, FM Mekkaniżmi molekulari tal-migrazzjoni taċ-ċelluli tal-crest newrali kranjali u l-mudelli matul l-iżvilupp kranjofaċjali.Żvilupp 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH u Murray, JK Xofftejn u palat mixquq: fehim ta 'influwenzi ġenetiċi u ambjentali.kumment naturali.Ġenetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Morfoġenesi anormali tal-ġilda, ir-riġlejn u r-reġjun kranjo-wiċċ fil-ġrieden defiċjenti tal-fattur 6 (Irf6) li jirregolaw l-interferon.Genette Nazzjonali.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Mutazzjonijiet dominanti f'GRHL3 jikkawżaw is-sindromu ta' van der Waord u jfixklu l-iżvilupp tal-periderm orali.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ u Juriloff, DM Aġġorna l-lista ta 'mutanti tal-ġrieden b'difetti fl-għeluq tat-tubu newrali u progress lejn fehim ġenetiku sħiħ tal-għeluq tat-tubu newrali.Investigazzjoni ta' difetti fit-twelid.Parti A, Teratoloġija Klinika u Molekulari 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. Is-sinjalar PDGFRalpha medjat minn PI3K jirregola s-sopravivenza u l-proliferazzjoni fl-iżvilupp skeletriku permezz ta 'mogħdija intraċellulari dipendenti fuq p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND u Murdoch, JN Disheveled: Relazzjoni ta 'espansjoni konverġenti għall-għeluq tat-tubu newrali.Xejriet fin-newroloġija.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).